II. TINJAUAN PUSTAKA
2.7 Metode Pengujian Salmonella sp
Pendeteksian salmonella sp. dengan adanya berbagai media spesifik yang cukup sensitif yang sangat membantu sensitifikasinya dalam pengujian, selain itu sensitifikasi pada pengujian salmonella sp. juga dapat dipertinggi dengan memperbanyak jumlah contoh yang diuji (Faraiaz, 1993).
Ukuran sampel yang umumuntuk volume broth parapengkayaan 1 : 10,
sampel diperkaya dengan nutrisi media nonselektif yang bertujuan untuk menyimpan kembali salmonella sp. yang rusak atau terluka pada saat pengolahan produk.
2.7.2 Pengkayaan
Broth pengkayaan selekif digunakan dalam analisa makanan dengan tujuan untuk meningkatkan populasi salmonella sp. dan menghambat organisme pada sampel makanan (Speck 1976).
Broth atau media yang digunakan adalah Selenite Cystine Broth (SCB), dan Tetrathionate Broth (TTB) serta Rappaport-Vassilliadis (RV) untuk produk dengan
kontaminasi tinggi. Penggunaan media SCB adalah dengan adanya kandungan selenit pada media ini akan menghambat bakteri coliform yang enterococci yang terjadi pada inkubasi pertama (6-12 jam). Efek dari adanya cysteine dapat mengurangi pertumbuhan bakteri hingga serendah mungkin dan selenit menghasilkan racun bagi beberapa jenis mikroorganisme coliform yang enterococci (Fachlam, 1990).
Media TTB dapat digunakan untuk pengkayaan salmonella sp. pada daging dan produk perikanan.Tetrathionate dihasilkan dari thio sulfat dengan penambahan iodine pada kultur yang fungsinya dapat menghambat bakteri coliform. Sedangkan bakteri salmonella sp. tidak dihambat dengan adanya tetrathionate, akan tetapi dapat mengurangi kandungan tetrathionate dengan menggunakannnya dalam proses metabolisme.
2.7.3 Isolasi Salmnella sp
Media selektif adalah media yang mampu menumbuhkan bakteri tertentu (bakteri target atau bakteri yang kita inginkan) dan menghambat pertumbuhan bakteri lain (bakteri non target).Kata kunci disini adalah “selektif”, yang artinya
memilih.Beberapa media agar yang umum digunakan dalam pengujian salmonella sp.
antara lain adalah Hectoen Enteric(HE) agar, Xylose Lysine Desoxycholate(XLD) dan Bismuth Sulfite Agar ( BSA ).
Pembacaan koloni salmonella sp. pada pada BSA yaitu koloni berwarna keabu-abuan atau kehitaman kadang-kadang metalik, media disekitar koloni berwarna coklat kemudian berubah hitam dengan semaki lamanya inkubasi (Anonim, 1999).
Media ini berfungsi untuk mengisolasi dan mengindentifikasi pendugaan salmonella sp. dan sigella yang lebih spesifik dari pada menggunakan media
SCB.Salmonella sp. dibedakan dari bakteri yang bukan pathogen dengan mempermentasi xylose dan lysine dalam media yang menyebabkan terjadinya warna pink dalam media.Bakeri yang bukan pathogen tidak dapat memfermentasikan xylose dan lysine keberadaan salmonella sp. ditandai dengan indikator H2S yang berarna hitam.
Media XLD mengandung sodium desoycholateuntuk menghambat coliform tanpa menurunkan kemampuan pertumbuhan salmonella sp. (Fachlam, 1990).Media ini merupakan media selektif yang digunakan untuk mengidentifikasi jenis salmonella sp. dan sigella dari bakteri pathogen yang lainnya. Penambahan
karbohidrat (sukrosa dan silisin) akan memberikan perbedaan pada koloni laktos (Fachlam, 1990).
2.7.4 Uji Biokimia
Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi
sel, yakni selama reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi maupun yang menggunakan energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan selular, seperti pergerakan. Suatu bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja, sehingga perlu diteliti sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya.Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tidak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pegamatan fisiologis yang memadai mengenai kandungan organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan.Karakterisasi dan klasifikasi sebagian mikroorganisme seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik maupun biokimia. Mikroorganisme dapat tumbuh pada beberapa tipe media yang memproduksi tipe metabolit yang dapat dideteksi dengan reaksi antara mikroorganisme dengan reagen test yang dapat menghasilkan perubahan warna reagen (Cowan, 2004).
Koloni yang terduga dari media selektif dipindahkan ketabung-tabung agar selektif isolasi karakteristik biokimia pendahuluan.Media yang umum digunakan yaitu Triple Sugar Iron (TSI) dan Lysin Iron Agar (LIA) (Speck, 1976).
Media TSIA tergolong media padat (berdasarkan bentuknya), media semisintesis (berdasarkan susunannya), dan media diferensial (berdasarkan sifatnya).Media padat biasanya digunakan untuk mengamati morfologi koloni dan mengisolasi biakan murni.Media semisintetis merupakan media yang tersusun oleh campuran bahan alami dan bahan sintetis.Sedangkan media diferensial adalah media yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba tertentu serta penentuan
sifat-sifatnya.Sebagai differensial medium, pertumbuhan bakteri memberikan koloni yang spesifik untuk masing-masing spesies yang didasarkan pada perubahan-perubahan secara kimiawi (Anonim, 2012).
Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA) merupakan metode yang digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam memfermentasikan gula.Medium TSIA mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa.Terdapat juga indikator fenol merah serta FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukanH2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam dan gas.Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja yang terlihat (Anonim, 2012).
LIA berbentuk padat, berwarna ungu di dalam tabung miring, Untuk mengeahui apakah bakteri manganduang enzim decorboxilase yang akan menguraikan lysine menjadi caqaverin yang bersifat basa, karena adanya indikator Brom Cresol Purple (BCP) tetap berwarna ungu.
Pada uji biokimia meliputi beberapa tahap tergantung dari permintaan konsumen atau perusahaan diantaranta yaitu uji idol.Media yang dipakai adalah pepton 1%.Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim triptophanase sehingga bakteri tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan membentuk indol.Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan reagen Ehrlich/Kovac’s yang berisi paradimetil amino bensaldehid. Interpretasi hasil : negatif (-) : Tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon.
artinya bakteri ini membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon(Cowan, 2004).
Uji urease, urease broth merupakan media differensial yang dapat membedakan bakteri penghasil eksoenzim yaitu enzim urease (untuk menghidrolisa urea menjadi amonia karbondioksida). Kandungan urease broth meliputi buffer, urea, sedikit nutrient, indikator phenol red. Phenol red berubah jadi kuningpada lingkungan asam dan berubah merah muda pada lingkungan basa. Prinsip uji urease yaitu media urea terdegradasi menjadi amoniak menyebabkan lingkungan basa, maka media menjadi merah muda .Sebagian besar bakteri golongan enteric dapat mendegrasi urea, tetapi lambat.Fungsi uji urease adalah mendeteksi bakteri yang dapat mendegradasi dengan cepat “urease- positif” (Anonim, 2011).
Uji gula-gula, uji gula-gula digunakan untuk melihat adanya kemampuan bakteri dalam memfermentasikan karbohidrat menjadi asam-asam organik, yaitu dengan adanya perubahan warna indikator yang terdapat dalam pemberian warna merah menjadi warna kuning.Dimana mokroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang selanjutnya difermentasi menjadi asam-asam organik disertai atau tidak terbentuknya gas. Organisme-organisme yang berbeda akan menggunakan karbohidrat yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang dimilikinya (Anggi, 2012).
Potassium Cyanide Broth (KCN broth) adalah media yang ditunjukkan untuk
mengetahui sensitifikasi mikroorganisme terhadap KCN. Cara kerja KCN terhadap mikroorganisme yang diuji yaitu dihambatnya pertumbuhan beberapa dengan konsentrasi yang sangat lambat dari KCN.Sebagian kecil mikroba yang sensitif dapat
tumbuh pada media ini dan menyebabkan kekeruhan.Salmonella sp. menunjuka reaksi negatif terhadap KCN.Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan (Anonim, 1994).
Uji pada malonate broth terhadap mikroorganisme bila reaksi negatif tidak terjadi perubahan warna media yaitu tetap berwarna hijau, sedangkan bila hasil positif akan bersifat alkalin ditunjukkan dengan perubahan warna media semula berwarna hijau menjadi warna biru karena reaksi alkalin dari indikator bromethymol blue.
Sebagian besar salmonella sp. hasil negatif (Speck, 1976).
Uji Methyl Red (MR), media yang digunakan adalah pepton glukosa phosphat.
Uji ini digunakan untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran (metilen glikon). Hasil negatif jika tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambah methyl red 1% dan positif jika terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan methyl red 1%. Artinya bakteri menghasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam media MR (Cowan,2004).
Uji Voges-Proskuaer (VP), media yang dipakai adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini digunakan untuk mengetahui pembentukan asetil metil karbinol (asetoin) dari hasil fermentasi glukosa. Hasil negatif jika tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan alfa naphtol 5% dan KOH 40% dan positif jika terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan alfa naphtol 5% dan KOH 40%, artinya hasil akhir fermentasi bakteri adalah asetil metil
Uji Citrate, media yang dipakai adalah simons citrat. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon.
Pada media simons citrat berisi indikator BTB (Brom Tymol Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru.Hasil negatif jika tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga bakteri tidak menggunakan citra sebagai salah satu atau satu-satunya sumber karbon. Positif jika terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya bakteri menggunakan citrat sebagai salah satu atau satu-satunya sumber karbon (Ratna, 2012).
2.7.5 Tahap Uji Serologi
Uji serologi digunakan untuk mengetahui secara kualitatif dan kuantitatif respon tubuh terhadap penyakit infeksi.Uji serologi digunakan dalam diagnosatik penyakit infeksi karena karena reaksinya spesifik, selain itu hasil uji memerlukan waktu yang jauh lebih pendek dari pada uji diagnostik yang biasanya dilakukan.
Kontrol positif dan negatif diperlukan dalam pengujian, karena untuk memastikan bahwa cara mengerjakan dan antiserum yang digunakan benar. Hasil pengujian sah bila kontrol positif dan negatif menujukkan hasil yang sesuai (Bibiana, 1994).
Menurut Ratna, dkk, (1988) antigen di dalam reaksi dapat berupa sel atau partikel. Serotype salmonella sp. ditandai dengan adanya antigen somatik (O) dan flagelar (H) sangat minolog dalam identifikasi. Uji aglutinasi polyvalent somatic (O) delakukan dengan metode glass objek yang menggunakan biakan bakteri dari TSI.