Penelitian ini dilaksanakan di PT. IndoAnilab, Taman Kencana, Bogor dan Laboratorium Patologi dan Lipid Pusat Studi Satwa Primata-IPB (PSSP-IPB), Bogor dari bulan Desember 2007 sampai bulan Juni 2008.
Materi
Hewan Model
Penelitian ini menggunakan 15 ekor monyet ekor panjang (MEP) dewasa berjenis kelamin jantan, bobot badan berkisar antara 4-5 kg, dan berumur 6-8 tahun. Monyet yang digunakan berasal dari kandang Penangkaran Pusat Studi Satwa Primata di Darmaga Bogor yang bebas dari agen penyakit (patogen).
Pakan
Pakan diberikan dua kali sehari yaitu pagi dan sore. Minum diberikan ad libitum. Selama penelitian monyet diberi perlakuan pakan buatan yang telah diformulasi dengan komposisi antara lain: gandum, gula, lemak sapi, minyak goreng, tepung ikan, tepung maizena, bungkil kedelai, dedak padi, agar Swallow, CMC (carboxymethyl cellulase), Premix, kalsium karbonat, kalsium fosfat dan kuning telur. Pakan yang digunakan mengandung lemak dan pati yang tinggi dengan energi sebesar masing-masing 4.480 kal/g dan 4.207 kal/g. Komposisi pakan energi tinggi (pakan A dan B) dapat dilihat pada Tabel 5.
Pada periode ke-dua penelitian (minggu ke-5 s/d minggu ke-8), MEP terlihat mengalami cekaman. Cekaman ini diekspresikan melalui tingkah laku yang selalu membuang air minum, memukul-mukul tempat minum ke lantai kandang bahkan ada satu ekor monyet yang mencabuti bulunya sendiri. Sesuai dengan aturan yang dikeluarkan oleh Animal Care and Use Commitee (ACUC yaitu Komisi Kesejahteraan Hewan Percobaan) PT. IndoAnilab dengan nomor protokol: 01-IA-ACUC-08, maka pada periode ke-3 penelitian monyet ekor panjang diberikan
17 enrichment. Bentuk enrichment tersebut adalah pemberian potongan buah-buahan seperti pisang, pepaya, jambu biji dan apel (±10 g/ekor) dalam bentuk kubus es.
Tabel 5. Komposisi Pakan Berenergi Tinggi (Pakan A dan Pakan B)
Bahan Pakan Pakan A Pakan B
--- (%) --- Gandum Gula Minyak goreng Tepung ikan Tepung maizena Bungkil kedelai Dedak padi Agar-agar CMC (carboxymethyl cellulose) Mineral mix Kuning telur Tallow Total 42,0 10,0 10,0 6,5 8,0 5,0 4,0 1,5 1,0 2,0 - 10,0 100,0 42,0 8,0 10,0 4,0 8,0 4,0 4,0 1,0 1,0 2,0 10,0 6,0 100,0 Kandang
Kandang yang digunakan adalah kandang individu yang terbuat dari stainless steel (squeeze back cage) untuk mempermudah pemeliharaan dan pengendalian. Setiap kandang dilengkapi dengan tempat pakan dan air minum ad libitum. Kandang ditempatkan pada ruang tertutup dan bersih serta didesain sedemikian rupa sehingga monyet masih dapat saling melihat dan mendengar sesamanya. Di dalam ruangan kandang disediakan kran air, alat pembersih kandang, exhaust fan, dan ventilasi. Bahan dan Alat
Bahan dan alat yang digunakan untuk pengumpulan darah adalah syringe 5 ml, tabung darah (vacutainer) 5 ml yang telah berisi antikoagulan EDTA, obat bius (ketamin dengan dosis 0,01 mg/kg bobot badan), rak untuk tabung darah,
18 kapas/tissue, cool box dan dry ice. Bahan dan alat yang digunakan untuk pemeriksaan darah adalah contoh darah, alkohol 70%, Giemsa 10%, methanol, minyak imersi, syringe 5 ml, mikroskop cahaya (merek Nikon YB100), handcounter, kapas/tissue, gelas objek(merek Sail Brand), kaca penutup preparat, pipet mikro dan hematology analyzer (merek Nihon Kohden, Celltax). Gambar berikut merupakan contoh gambar mesin penganalisis contoh darah (hematology analyzer).
Gambar 2. Hematology Analyzer Rancangan Percobaan Perlakuan
Sebanyak 15 ekor monyet ekor panjang dibagi secara acak untuk mendapatkan 3 macam perlakuan pakan dengan ulangan sebanyak 5 ekor. Pakan A (n = 5 ekor) mengandung energi sebesar 4.480 kal/g, lemak 19,62%, dan BETN 59,42%. Pakan B (n = 5 ekor) mengandung energi 4.207 kal/g, lemak 19,62% dan BETN 60,34%. Pakan C (monkey chow) (n = 5 ekor) energi 4.330 kal/g, lemak 5,55% dan BETN 51,38%.
Peubah yang Diamati
Peubah untuk nilai hematologi adalah jumlah sel darah merah (106/ml), kadar hemoglobin (g/dl), nilai hematrokrit (%), nilai Mean Corpuscular Volume (MCV) (fl), Mean Corpusular Hemoglobin (MCH) (ρg) dan nilai Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC) (g/dl). Peubah untuk diferensiasi sel adalah neutrofil (%), eusinofil (%), basofil (%), limfosit (%) dan monosit (%).
19 Prosedur
Tahapan Persiapan dan Adaptasi
Adaptasi suatu individu terhadap perubahan lingkungan sangat bervariasi bergantung pada kondisi perubahan yang dialami. Dalam penelitian ini terjadi perubahan ransum lama dengan ransum baru untuk bahan penelitian. Selama penggantian ransum diperlukan masa adaptasi sampai hewan tertarik dan mengonsumsi ransum yang baru dan masa adaptasi masing-masing individu berbeda. Persiapan penelitian ini dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama adalah persiapan dan masa adaptasi kandang, sedangkan tahap kedua adalah masa adaptasi pakan.
Monyet ekor panjang (MEP) dipelihara dalam kandang individu untuk mengurangi aktivitas harian dan diberi pakan monkey chow pada masa adaptasi kandang selama 60 hari. Kandang individu MEP ditempatkan dalam ruang tertutup, dan diposisikan sedemikian rupa, sehingga setiap MEP bisa saling melihat dan mendengar satu sama lain. Tiap kandang individu dilengkapi dengan tempat pakan, tempat minum ad libitum, kran air, selang, lampu dan termometer. Setelah adaptasi kandang, MEP dihabituasi terhadap pakan penelitian selama 10 hari. Selama masa adaptasi, baik kandang maupun pakan, MEP tidak menunjukkan kelainan ataupun gangguan kesehatan yang berarti.
Pemberian pakan dilakukan dua kali sehari, yaitu pagi hari pukul 09.00 WIB dan siang hari pukul 13.00 WIB. Selain itu, pada siang hari diberikan pakan tambahan yaitu satu buah pisang per hari (40-80 g/ekor). Minum diberikan ad libitum. Pada awal perlakuan pakan MEP menunjukkan ekspresi ketakutan dan kegelisahan saat peneliti masuk kandang dan saat pemberian pakan atau minuman. Namun, setelah 3 minggu MEP mulai terbiasa setiap peneliti masuk dan memberikan pakan atau minuman.
Pengumpulan Data
Data diperoleh melalui pengamatan dan pengambilan darah yang dilakukan setiap bulan (4 minggu), yaitu bulan ke-0, ke-1, ke-2, ke-3, dan ke-4. Seperti yang telah disebutkan di atas bahwa untuk setiap perlakuan diberikan 5 ulangan.
20 Pengamatan dilakukan pada masing-masing individu, sehingga pada setiap pengamatan didapatkan 15 data untuk masing-masing peubah.
Pengumpulan Contoh Darah
Darah diambil di daerah vena femoralis menggunakan syringe 5 ml. Sebelum darah diambil, monyet dibius terlebih dahulu dengan ketamin dosis 0,01 mg/kg secara intramusculer (Fortman et al., 2001). Contoh darah kemudian dibawa ke Laboratorium Patologi dan Lipid PSSP IPB untuk diamati profil darah MEP selama perlakuan pakan.
Perhitungan Jumlah Sel Darah Merah
Perhitungan jumlah sel darah merah dilakukan dengan alat kamar hitung sel darah merah menggunakan mikroskop dengan pembesaran 100 kali (objektif 10 kali dan okuler 10 kali). Prosedur pengerjaannya sebagai berikut: aspirator dipasang pada pipet sel darah merah. Darah yang telah dihisap sampai batas angka 0,5 pada pipet. Ujung pipet dibersihkan dengan menggunakan tissu. Dengan cepat dan hati-hati larutan Hayem dihisap sampai tanda 101 yang tertera pada pipet. Pada pengisapan ini dihindari adanya gelembung, jika terdapat gelembung maka prosedur harus diulang. Selanjutnya aspirator dilepas dari pipet sel darah merah. Dengan menggunakan ibu jari dan telunjuk kanan, isi pipet dikocok dengan membuat gerakan angka 8 selama 3 menit. Bagian yang tidak ikut terkocok dibuang. Selanjutnya dengan hati-hati cairan dimasukkan ke dalam kamar hitung dengan cara menempelkan ujung pipet pada pertemuan antara dasar kamar hitung dan kaca penutup. Butir-butir darah dibiarkan mengendap selama kurang lebih satu menit. Agar tidak terjadi penghitungan yang berulang maka sebaiknya menggunakan hand counter. Untuk menghitung sel darah merah dalam hemositometer, digunakan kotak sel darah merah yang berjumlah 25 buah dengan mengambil bagian sebagai berikut: satu kotak pojok kanan atas, satu kotak pojok kiri atas, satu kotak di tengah, satu kotak di pojok kanan bawah, dan satu kotak di pojok kiri bawah. Untuk membedakan kotak sel darah merah dengan kotak leukosit dapat berpatokan pada tiga garis pemisah pada kotak sel darah merah dan luas kotak sel darah merah relatif lebih kecil dibandingkan dengan kotak leukosit. Setelah jumlah sel darah merah didapatkan maka jumlah darah merah dikalikan
21 dengan 104, untuk mengetahui jumlah sel darah merah dalam 1 mm3 darah (Sastradipraja et al., 1989).
Perhitungan Kadar Hemoglobin
Metode yang digunakan untuk mengukur kadar hemoglobin dalam penelitian ini adalah metode Sahli. Larutan HCl 0,01 N diteteskan pada tabung Sahli sampai tanda tera 0.1 atau garis bawah, kemudian sampel darah dihisap menggunakan pipet hingga mencapai tanda tera atas (2 ml). Sampel darah segera dimasukkan ke dalam tabung dan ditunggu selama 3 menit atau hingga berubah warna menjadi coklat kehitaman akibat reaksi antara HCl dengan hemoglobin membentuk asam hematid. Setelah itu larutan ditambah dengan aquadest, teteskan sedikit demi sedikit sambil terus diaduk. Larutan aquadest ditambah hingga warna larutan sama dengan warna standar hemoglobinometer. Nilai hemoglobin dapat dilihat di kolom ”gram %” yang tertera pada tabung hemoglobin (Sastradipraja et al., 1989).
Perhitungan Nilai Hematokrit
Penentuan nilai hematokrit dilakukan dengan mengisi tabung hematokrit dengan darah dan antikoagulan. Campuran darah kemudian disentrifikasi sampai sel-sel mengumpul di dasar. Nilai hematokrit dapat lansung diketahui baik langsung maupun tidak langsung dalam tabung tersebut. (Frandson, 1986).
Pengisisan pipa mikrometer dilakukan dengan memiringkan tabung yang berisi sampel darah dengan menempatkan ujung mikrokapiler yang bertanda merah. Pipa diisi sampai mencapai dua per tiga bagian kemudian ujung pipa disumbat dengan crestoseal, kemudian pipa mikrokapiler tersebut disentrifikasi selama 15 menit dengan kecepatan 2.500-4000 rpm. Bagian yang tersumbat diletakkan menjauhi pusat sentrifuse. Nilai hematokrit ditentukan dengan mengukur persentase volume sel darah merah dengan menggunakan alat baca mikrohematokrit (microcapillary hematocrit reader) (Sastradipraja et al., 1989).
22 Perhitungan Nilai Mean Corpuscular Volume (MCV), Mean Corpuscular Hemoglobin (MCH) dan Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration
(MCHC).
Satuan untuk MCV, MCH dan MCHC secara berturut-turut adalah femtoliters (fl, 1 fl = 10-15 l), picograms (ρg) dan g/dl. Untuk menghitung nilai MCV, MCH dan MCHC, digunakan rumus berikut:
MCV = MCH = MCHC =
Analisis Contoh Darah Menggunakan Hematology Analyzer
Cara penghitungan yang telah diuraikan tersebut di atas merupakan cara penghitungan secara manual. Pada penelitian ini digunakan Hematology Analyzer MEK-6450K Nihon Kohden, Celltax® untuk memperoleh informasi profil darah monyet ekor panjang selama perlakuan pakan. Cara penggunaan hematology analyzer adalah sebagai berikut ini.
1. Persiapan Pemeriksaan:
a. Jenis hewan asal contoh darah dipilih pada kotak “animal type”. Contoh: dog, cat, rat, horse, monkey, dan lain-lain.
b. Pada layar kanan atas, nama dan nomor label contoh darah dengan menekan tombol “SET”, untuk nama tombol yang ditekan adalah tombol “ABC” dan “123” untuk nomor contoh darah. Kemudian tombol “OK” ditekan.
2. Pemeriksaan
a. Contoh darah dihomogenkan kemudian diletakkan pada aspirator (di samping nozzle).
b. Pada panel kontrol, tombol “switch count” ditekan. (juta/ml) merah darah sel Jumlah 10 x (%) Hematokrit (juta/ml) merah darah sel Jumlah 10 x (g/dl) Hemoglobin (%) Hematokrit 100 x (g/dl) Hemoglobin
23 c. Hasil akan muncul kurang lebih setelah 1 menit kemudian.
d. Untuk mencetak hasil analisis contoh darah, tekan icon “print” pada layar.
Perhitungan Diferensiasi Sel Darah Putih
Darah yang telah disiapkan diteteskan ke gelas objek bersih. Kedua sudut sebelah kiri kaca objek dipegang dengan ibu jari dan telunjuk tangan kiri dan kaca penutup dipegang tangan kanan (pinggiran kaca penutup dipegang ibu jari dan keempat jari tangan kanan), kemudian ujung kaca penutup ditempelkan dengan membentuk sudut kurang lebih 30o. Setelah itu, kaca penutup didorong dengan kecepatan konstan sehingga didapatkan ulasan yang tidak terlalu tebal. Ulasan dikeringkan selama beberapa menit. Lalu ulasan difiksasi dalam metanol selama 5–10 menit dan dikeringkan. Setelah fiksasi dengan larutan metanol, preparat ulas dicelupkan ke dalam pewarna Giemsa selama 30 menit. Kemudian ulasan diangkat dan dicuci menggunakan air mengalir sampai air bilasan tidak membawa warna Giemsa. Preparat ulasan dikeringkan. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 100 x 10 (Sastradipraja et al., 1989).
Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak pola faktorial dengan faktor periode tersarang pada perlakuan pakan. Model matematis yang digunakan didasarkan pada Gill (1978) yaitu
Yij = µ + τi + Eij + εijk Keterangan:
Yijk = data pengamatan, µ = nilai tengah populasi, τi = pengaruh pakan ke-i,
Eij = pengaruh periode ke- j tersarang pada perlakuan pakan ke-I, εijk = galat percobaan dari pengaruh periode ke-j tersarang pada
perlakuan pakan ke-i ulangan ke-k, i = perlakuan pakan,
j = pengaruh periode, dan k = ulangan (1,2,..,5).
24 Data yang diperoleh kemudian ditabulasi dan divisualisasikan dalam bentuk grafik. Data yang mempunyai nilai di bawah 30% (eosinofil, basofil, dan monosit) ditransformasi (archsin) terlebih dahulu sebelum diolah. Data hasil penelitian ini diolah dengan analisis statistik berupa uji ANOVA untuk melihat pengaruh perlakuan pakan yang diberikan dan pengaruh periode yang tersarang pada perlakuan pakan. Setelah diketahui bahwa perlakuan pakan mempunyai pengaruh yang nyata terhadap peubah-peubah yang diamati maka dilakukan uji lanjut untuk melihat pengaruh masing-masing pakan dibandingkan dengan pakan lainnya. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan. Perangkat lunak yang digunakan untuk analisis secara statistik ini adalah program SAS.
TINJAUAN PUSTAKA