3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September 2012 sampai dengan bulan Maret 2013 di Laboratorium Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif hidayatullah Jakarta yaitu : Laboratoirum Bioavaibility dan Bioequivalensi (PBB) Program Studi Farmasi, Laboratorium Multiguna Program Studi Pendidikan Dokter, Laboratorium Enviromental Health (HEN) Program Studi Kesehatan Masyarakat, Laboratorium Animal House Program Studi Pendidikan Dokter dan Laboratorium Patologi dan Anatomi Universitas Indonesia.
3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam sediaan film kitosan yaitu : Timbangan analitik, spuit, hot plate stirer (Wigen Hauser), pH meter (Horiba), oven (Eyela NDO-400), sonikator (Bransonic 5510), buret, pengaduk magnetik, gelas kimia, gelas ukur, labu ukur, spatula, dan pipet mikro (Wigen Hauser).
Untuk uji in vivo terhadap hewan tikus yaitu : Alat bedah, kandang tikus, kertas, jarum suntik, kapas, toples, plat logam, sedangkan untuk pembuatan sediaan histologi yaitu gelas objek dan gelas penutup, penangas air, mikrotom, tissue processor dan mikroskop cahaya.
3.2.2. Bahan
Serbuk asiatikosida (Xi’an Guanyo Bio-tech, Cina), kitosan (PT. Biotech Surindo), asam laktat (PT. Bratachem), natrium tripolifosfat (NaTPP) (PT. Wako, Japan), natrium hidroksida (NaOH), gliserin (PT. Bratachem), sorbitol (PT. Bratachem), dan silika gel digunakan untuk pembuatan film kitosan dan evaluasi.
Untuk fiksasi kulit dan uji in vivo dengan menggunakan etanol 96%, eter, larutan buffer formalin 10%, larutan hematoksilin, larutan eosin, xylol, alkohol
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan konsentrasi bertingkat, parafin, alkohol 70%, xylazine 2%, dan ketamin
HCl 2%.
3.3. Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih betina (Rattus novergicus L.) galur Sprague Dawley yang sehat berumur 2-3 bulan dengan berat badan 180 - 250 gram. Hewan percobaan terdiri dari 6 kelompok perlakuan dengan masing- masing tiap kelompok ditentukan dengan cara sebagai berikut.
Tabel 3.1. Jumlah kelompok hewan uji
No. Kelompok Jenis perlakuan luka
1 KN Tanpa pengobatan (kontrol negatif)
2 KP Diberi suspensi asiatikosida 0,2% (kontrol positif)
3 FK Diberi film kitosan tanpa asiatikosida
4 FA1 Diberi film kitosan dengan asiatikosida 10%
5 FA2 Diberi film kitosan dengan asiatikosida 20%
6 FA3 Diberi film kitosan dengan asiatikosida 30%
I. Prinsip Rumus Federer, yaitu
(n-1) (t-1) ≥ 15
(n-1) (6-1) ≥ 15
(n-1) ≥ 3
n ≥ 4
Jadi jumlah minimum ulangan perlakuan yang diperlukan dalam setiap kelompok adalah 4 kali pada hewan coba.
Pada percobaan ini menggunakan 3 kelompok (luka) dalam 1 tikus, sedangkan untuk 6 kelompok yang digunakan untuk 1 ulangan perlakuan adalah 2 ekor tikus. Untuk evaluasi penurunan luas luka dalam 4 ulangan adalah 8 ekor dan
keterangan :
n : jumlah ulangan
t : jumlah kelompok perlakuan terhadap binatang coba
untuk evaluasi histologi dalam 2 ulangan adalah 4 ekor, sehingga jumlah tikus yang digunakan sebanyak 12 ekor.
3.4. Pembuatan Film Kitosan - Asiatikosida dan Evaluasinya 3.4.1. Preparasi Pelarut
1. Larutan kitosan + 1%
Kitosan ditimbang 4 gram dengan menggunakan kaca arloji, kemudian kitosan dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi aquadest 300 ml, ditambahkan larutan asam laktat 4% (4 ml asam laktat digenapkan hingga 100 ml aquadest) dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larut. Setelah itu, larutan kitosan disaring dengan bantuan vacum menggunakan corong porselen yang dilapisi kain.
2. Larutan NaTPP 0,1%
Sebanyak 1 gram ditimbang dengan menggunakan kaca arloji, kemudian dilarutkan dengan aquadest dalam gelas kimia. Setelah itu dimasukkan dalam labu ukur 1 L dan digenapkan dengan aquadest sampai tanda batas.
3. Larutan NaOH 0,1 N
NaOH sebanyak 4 gram ditimbang dengan menggunakan kaca arloji, kemudian dilarutkan dengan aquadest dalam gelas kimia. Setelah itu dimasukkan dalam labu ukur 1 liter dan digenapkan dengan aquadest hingga tanda batas.
3.4.2. Preparasi Film Sambung Silang Kitosan - TPP yang Mengandung Asiatikosida
Sebanyak 25 ml larutan kitosan 1% dimasukkan ke dalam gelas kimia, kemudian dilakukan pengadukan dengan menggunakan pengaduk magnetik dan pengadukan ini terus dilakukan selama proses pembuatan film. Setelah itu ditambahkan larutan NaTPP 0,1% kedalam larutan kitosan tersebut dengan menggunakan buret hingga 30 ml, kemudian ditambahkan NaOH 0,1 N ke dalam campuran tersebut dan dilakukan pengecekan secara berulang sampai pH 5 (dicek dengan pH meter). Setelah homogen sebagian larutan dipindahkan pada gelas kimia yang berbeda dan ditambahkan serbuk asiatikosida sedikit demi sedikit
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada gelas kimia semula yang sedang diaduk menggunakan pengaduk magnetik
hingga homogen. Setelah itu masukkan plasticizer sorbitol dan gliserin (1 : 1) sebanyak 187,5 µL sedikit demi sedikit ke dalam gelas kimia larutan campuran kitosan – asiatikosida dengan menggunakan mikropipet. Setelah itu ditambahkan sisa campuran larutan pada gelas kimia kedua sedikit demi sedikit ke dalam larutan campuran yang mengandung asiatikosida dan diaduk hingga homogen. Kemudian dilakukan sonikasi selama 10 menit agar gelembung-gelembung kecil dalam larutan campuran dapat naik ke permukaan. Gelembung-gelembung kecil yang terbentuk dihilangkan dengan menggunakan spatula. Setelah itu, tuangkan larutan campuran ke dalam cetakan atau wadah yang permukaannya rata dan keringkan pada temperatur 60˚C selama + 45 jam. Untuk menjaga kelembaban tetap konstan, film yang terbentuk dilakukan penyimpanan selanjutnya dalam wadah yang mengandung silika gel.
Tabel 3.2. Formula film kitosan
Keterangan : Nilai % (b/b) asiatikosida dihitung terhadap berat kitosan 3.5. Preparasi Suspensi Asiatikosida (Kontrol Positif)
Sebanyak 0,2 gram asiatikosida ditimbang, kemudian dilarutkan dengan cairan steril NaCl dan digenapkan hingga volume 100 ml.
3.6. Perlakuan Hewan Percobaan 3.6.1 Perlakuan pada Tikus
Tikus diaklimatisasi selama 1 minggu sebelum percobaan dengan di berikan pakan dan minuman ad libitum. Kemudian, setiap ekor tikus diberi tanda pengenal agar tidak salah dalam perlakuan.
Kel. Larutan Kitosan 1% Larutan NaTPP 0,1% Larutan NaOH 0,1 N Plasticizer Asiatikosida Gliserin : Sorbitol (1 : 1) Konsentrasi Berat FA1 25 ml 30 ml qs 187,5 µl 10% 25 mg FA2 25 ml 30 ml qs 187,5 µl 20% 50 mg FA3 25 ml 30 ml qs 187,5 µl 30% 75 mg FK 25 ml 30 ml qs 187,5 µl - -
3.6.2. Perlukaan pada Tikus
Pembentukan luka bakar ini dilakukan dengan mencukur rambut bagian punggung hewan yang sebelumnya dibius dengan 0,5 ml/100 gramBB tikus dosis kombinasi Xylazine 2% dan Ketamin HCl 2% (1,5 : 10). Prosedur yang dilakukan untuk membentuk luka bakar derajat tiga menggunakan plat logam berdiameter 1 cm yang dipanaskan pada suhu 100˚C kemudian ditempelkan pada punggung tikus selama 30 detik (Shuid et al., 2005). Luka ditunggu selama 10 menit lalu oleskan omiderm (debridemen enzimatis) dan ditunggu hingga 3 hari (Dihitung sebagai hari ke-0), kemudian diberi perlakuan bahan uji sesuai kelompoknya masing-masing.
3.6.3. Pemberian Obat Luka
Tabel 3.3. Jenis perlakuan dan pemberian tiap kelompok
No. Kelompok Jenis perlakuan luka Cara pemberian
1 KN Tanpa pengobatan
(kontrol negatif)
Tidak diberi obat
2 KP Diberi suspensi asiatikosida
0,2% (kontrol positif)
Diteteskan pada area luka 2 kali sehari
3 FK Diberi film kitosan tanpa
asiatikosida
Tempelkan FK pada area luka
4 FA1 Diberi film kitosan dengan
asiatikosida 10%
Tempelkan FA1 pada area luka
5 FA2 Diberi film kitosan dengan
asiatikosida 20%
Tempelkan FA2 pada area luka
6 FA3 Diberi film kitosan dengan
asiatikosida 30%
Tempelkan FA3 pada area luka
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.7. Evaluasi Penurunan Luas Area Luka
Masing-masing tikus diamati setiap kelompok yang mengalami luka bakar pada punggungnya dengan memperhatikan perubahan luas area luka pada hari ke- 0, 3, 7 dan 14. Kemudian dihitung persentase penurunan luas area luka tikus (Datta et al., 2009), berdasarkan rumus sebagai berikut :
W0 = berat kertasyang sesuai dengan gambar luas area luka Wt = berat rata-rata kertas bentuk lingkaran berdiameter 1,5 cm 1,76625 = luas lingkaran diameter 1,5 cm
3.8. Preparasi dan Uji Histologi
3.8.1. Pengambilan Sampel Kulit (Biopsi)
Biopsi kulit dilakukan pada luka bakar yang mulai menutup di setiap kelompok yang diambil pada hari ke-0, 7 dan 14 pasca perlukaan setelah tikus dibuat kondisi euthanasi dengan menggunakan eter dosis berlebih. Kemudian kulit area luka dipotong dengan menggunakan gunting tajam yang telah disterilkan terlebih dahulu.
Kulit yang telah di potong dengan ukuran 1,5 cm x 1,5 cm di fiksasi dengan menggunakan larutan BNF (Buffer Netral formalin) 10%. Kemudian potongan sediaan kulit dimasukkan ke dalam kaset tissue dan didehidrasi dengan cara merendam sediaan berturut – turut ke dalam alkohol 70%, 80%, 90%, alkohol absolut 1, alkohol absolut II, xylol 1, xylol II, parafin I, dan terakhir parafin II.
% Penurunan Luas Luka hari ke – n = 100% – ( –
x
100%)Luas area luka =
x L
=
Pemotongan dengan mikrotom dilakukan dengan ketebalan 2 - 4 mikron. Selanjutnya dilakukan pewarnaan umum Haematoksilin Eosin sebagai dasar pemulasan dan untuk mengamati jaringan ikat.
3.8.2. Pengamatan Histologi
Pengamatan histologi dilakukan pada sampel kulit dari sayatan tiap kelompok yang telah diambil pada hari ke-0, 7 dan 14 dengan mengamati kandungan pada jaringan ikat berupa jumlah sel-sel radang, neovaskularisasi, tebal serabut kolagen.
4.1. Analisa Data
Hasil pengamatan penurunan luas area luka diuji secara statistik menggunakan ANOVA. Dan hasil pengamatan histologi berupa perubahan pada jaringan ikat seperti seperti sel-sel radang, neuvaskularisasi dan serabut kolagen diuji secara deskriptif.
26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4