3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Sampel diambil dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari, Provinsi Papua Barat. Ekstraksi dan uji aktivitas antioksidan dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Kimia Analitik, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, dan Pusat Laboratorium Terpadu IPB-Bogor. Identifikasi senyawa antioksidan dilakukan di Balai Pengkajian Bioteknologi (Biotech Center-BPPT), Serpong. Penelitian dilaksanakan dari bulan Agustus 2010 – Maret 2011. Gambar 6 menunjukkan diagram alir penelitian komposisi kimia dan senyawa antiokksidan dari ekstrak tambelo (Bactronophorus thoracites).
Gambar 6 Diagram alir penelitian komposisi kimia dan senyawa antioksidan dari ekstrak tambelo (Bactronophorus thoracites).
Tambelo kering
Maserasi dengan MeOH
Ekstraksi dengan MeOH
Partisi dengan pelarut n-heksan, dan etil asetat
Ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol
Uji antioksidan Ekstrak terplilih KLT
Eluen terbaik Kromatografi kolom
Uji Fitokima Uji antioksidan
Fraksi terpilih Identifikasi dengan LC-MC Uji Fitokima Analisis kimia : - uji proksimat - uji asam amino - uji asam lemak - uji mineral
3.2 Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tambelo yang berasal dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari, Propinsi Papua Barat. Tambelo diperoleh dari batang pohon mangrove Rhizopora yang sudah lapuk. Tambelo dibersihkan dengan melepaskan cangkang dan pallet kemudian dikeringkan dengan menggunakan freezer dry. Tambelo kering selanjutnya digiling dengan menggunakan mortar dan disimpan pada suhu rendah (5-10 oC) sampai siap untuk dianalisis.
Bahan kimia yang digunakan untuk ekstraksi adalah n-heksana, etil asetat, metanol, dan kertas saring Whatman 40. Bahan kimia yang digunakan untuk uji antioksidan adalah DPPH (1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl), BHT dan vitamin super ester C sebagai standar. Bahan untuk uji fitokimia adalah H2SO4, akuades, kloroform p.a (pengenceran), anhidra asetat, asam sulfat pekat, HCl 2N, pereaksi
Dregendorff, pereaksi Wagner, pereaksi Meyer, serbuk magnesium, alkohol, HCl 37%, etanol 70%, FeCl3 5%, pereaksi Molish, pereaksi benedict, pereaksi
biuret, dan larutan ninhidrin 0,1%.
Peralatan utama yang digunakan adalah kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom (KK), spektrofotometer UV-Vis JENWAY 6305, kromatografi cair (LC-MS) AGILENT TECHNOLOGIES, vacum rotary evaporator Buchi Rotavapor R-205, dan Spektrofotometer serapan atom (SSA) Shimazu-7000.
3.3 Prosedur Penelitian
Penelitian ini terbagi atas dua tahap, yaitu 1) analisis komponen kimia tambelo, dan 2) Ekstraksi bahan aktif tambelo. Penelitian tahap pertama meliputi analisis rendemen, uji proksimat, asam lemak, asam amino, dan mineral. Tahap kedua meliputi ekstraksi bahan aktif dengan metode maserasi, partisi cair-cair, uji fitokimia, uji antioksidan dengan metode DPPH, dan identifikasi senyawa antioksidan dari bahan aktif yang dihasilkan.
3.3.1 Penelitian tahap pertama
Penelitian tahap pertama ini bertujuan untuk mendapatkan presentase bagian tubuh yang dapat dimanfaatkan dan memperoleh nilai kandungan gizi atau komposisi kimia dari tambelo. Analisis kandungan gizi terdiri dari analisis
23
proksimat yang meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan karbohidrat, analisis asam amino, serta asam lemak.
3.3.1.1 Rendemen (Hustiany 2005)
Tambelo dikeluarkan dari freezer, dicairkan kemudian ditimbang beratnya selanjutnya dikeringkan dengan menggunakan freezer dry. Daging tembelo yang sudah kering ditimbang kembali untuk mengetahui penurunan berat setelah dikeringkan. Rendemen merupakan presentase perbandingan antara bagian yang digunakan dengan berat utuh tambelo segar, dengan rumus :
3.3.1.2 Uji proksimat (AOAC 2005)
Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan abu dengan metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet, dan uji kadar protein menggunakan metode kjedahl.
a) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah
mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 oC selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 30 menit)
hingga dingin kemudian ditimbang hingga beratnya konstan (A). Tambelo ditimbang sebanyak 1-2 g (B), kemudian dimasukan kedalam cawan. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 oC selama 6 jam. Cawan tersebut kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang bobotnya (C). Kadar air ditentukan dengan rumus:
Keterangan:
A = berat cawan kosong (gram)
B = berat sampel sebelum dioven (gram)
C = berat cawan berisi sampel setelah dioven (gram) b) Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Analisis kadar abu dilakukan menggunakan metode oven. Prinsipnya adalah pembakaran atau pengabuan bahan-bahan organik yang diuraikan menjadi
air (H2O) dan karbondioksida (CO2) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zat anorganik ini disebut abu. Prosedur analisis kadar abu dalam bahan pangan adalah sebagai berikut: cawan abu porselin yang kosong dimasukkan ke dalam oven. Cawan abu porselin dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian cawan abu porselin kosong ditimbang untuk mengetahui bobot cawan kosong (A). Sampel yang telah dihomogenkan ditimbang 2 gram dan dimasukan ke dalam cawan abu porselin ditimbang (B), kemudian masukan ke dalam oven bersuhu 550-600 oC selama 24 jam atau sampai pengabuan sempurna, sehingga diperoleh abu berwarna putih, setelah selesai, suhu tungku pengabuan diturunkan hingga suhu 40 oC. Cawan porselin dikeluarkan dengan menggunakan penjepit dan masukan ke dalam desikator selama 30 menit.
Apabila abu belum putih benar harus dilakukan pengabuan kembali. Abu dibasahi (dilembabkan) dengan akuades secara bertahap, kemudian dikeringkan menggunakan hot plate dan diabukan kembali pada suhu 550-600 oC sampai diperoleh berat yang konstan. Suhu pengabuan diturunkan sampai ± 40 oC lalu dipindahkan cawan abu porselin ke dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang bobotnya (C) segera setelah dingin. Kadar abu dalam bahan pangan dapat dihitung berdasarkan persamaan berikut :
Keterangan:
A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat sampel sebelum pengabuan (gram)
C = Berat cawan berisi sample setelah pengabuan (gram) c) Analisis kadar protein (AOAC 2005)
Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode total nitrogen yang didasarkan pada reaksi penetralan asam basa. Kadar protein dihitung berdasarkan kesetimbangan reaksi kimia. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.
Tahapan destruksi adalah sebagai berikut: sampel dilumatkan dengan blender hingga partikelnya dapat melewati saringan 20 mesh. Sampel dimasukan dalam kantong plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Homogenat sampel ditimbang 2 gram pada kertas timbang, kemudian dimasukan ke dalam labu
25
destruksi. Sampel tersebut selanjutnya ditambahkan dua tablet katalis serta
beberapa butir batu didih. Sampel ditambahkan 15 mL asam sulfat pekat (95-97%) dan 3 mL hidrogen peroksida secara perlahan dan didiamkan 10 menit
dalam ruang asam. Destruksi dilakukan pada suhu 410 oC selama 2 jam atau sampai larutan jernih. Sampel hasil destruksi didiamkan hingga mencapai suhu kamar dan tambahkan 50-75 mL akuades.
Tahap kedua adalah distilasi, posedur tahapan ini sebagai berikut: sebanyak 25 mL larutan H3BO3 4% yang mengandung indikator sebagai penampung destilat dimasukan dalam erlenmeyer. Labu yang berisi hasil
destruksi dipasang pada rangkaian alat destilasi uap, kemudian ditambahkan 50-75 mL larutan natrium hidroksida dan natrium thiosulfat dan dilakukan
destilasi, selanjutnya destilat ditampung ke dalam erlenmeyer tersebut hingga volume mencapai minimal 150 mL (hasil destilasi akan berubah menjadi kuning).
Tahap ketiga adalah titrasi hasil destilat dengan HCl 0.2 N, yang sudah dibakukan sampai warna berubah dari hijau menjadi abu-abu netral. Analisis standar blanko dilakukan seperti tahapan sampel. Kadar protein dapat dihitung dengan persamaan berikut :
Keterangan : KP = Kadar Protein
Va = mL HCl untuk titrasi sampel Vb = mL HCl untuk titrasi blanko N = Normalitas HCl yang digunakan W = berat sampel
c) Analisis kadar lemak (AOAC 2005).
Prinsip analisis kadar lemak diawali dengan melakukan pengekstrakan sampel dengan pelarut organik untuk mengeluarkan lemak dengan bantuan pemanasan pada suhu titik didih pelarut selama 8 jam. Pelarut organik yang mengikat lemak selanjutnya dipisahkan dengan proses penguapan (evaporasi), sehingga hasil lemak tertinggal dalam labu. Penetapan bobot lemak dihitung secara gravimetri.
Sampel dilumatkan hingga homogen dan dimasukan ke dalam wadah plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Apabila sampel tidak langsung
dianalisis, maka disimpan dalam refrigerator sampai saatnya akan dianalisis. Sampel dikondisikan pada suhu ruang dan pastikan sampel masih homogen sebelum ditimbang. Apabila terjadi pemisahan cairan dan sampel, maka dilakukan pengadukan ulangan dengan blender sebelum dilakukan pengamatan. Prosedur analisis lemak adalah sebagai berikut : labu alas bulat ditimbang dalam keadaan kosong (A). Homogenat sampel ditimbang sebanyak 2 gram (B) dan masukan ke dalam selongsong lemak (ekstraction timbles). Berturut-turut dimasukan 150 mL n-heksana ke dalam labu alas bulat, selongsong lemak ke dalam ekstractor soxhlet, dan pasang rangkaian sokhlet dipasang dengan benar. Ekstraksi dilakukan pada suhu 60 oC selama 8 jam. Campuran lemak dan heksana dalam labu alas bulat dievaporasi sampai kering. Labu alas bulat yang berisi lemak dimasukan ke dalam oven bersuhu 105 oC selama ± 2 jam untuk menghilangkan
sisa n-heksana dan air. Labu dan lemak didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Labu alas bulat yang berisi lemak ditimbang (C) sampai berat konstan.
Kadar lemak dalam bahan pangan dapat dihitung berdasarkan persamaan berikut :
Keterangan: KL = kadar lemak A = bobot contoh
B = bobot labu lemak dan labu didih C = bobot labu lemak, batu didih dan lemak d) Analisis kadar karbohidrat (AOAC 2005)
Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan menggunakan metode by difference yaitu pengurangan 100 % dengan jumlah dari hasil empat komponen yaitu kadar air, protein, lemak dan abu. Perhitungannya sebagai berikut:
% Karbohidrat = 100 % - ( % air + % lemak + % protein + % abu ) 3.3.1.3Analisis asam amino (AOAC 1994)
Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Perangkat HPLC sebelum digunakan harus dibilas dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe
27
amino menggunakan HPLC disajikan Gambar 7. Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino:
Temperatur : 27 oC (suhu ruang) Jenis kolom : pico tag 3,9x150 μm Kecepatan alir eluen : 1 ml/menit
Tekanan : 3000 psi
Fasa gerak : - Asetoniril 60% - Buffer fosfat 0,1 M
Detektor : UV
Panjang gelombang : 256 nm
Derivatisasi : derivatisasi pre-kolom
Tipe injeksi : on column injection tanpa septum
Program : isokratik (kecepatan aliran eluen konstan)
Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan : C = konsentrasi standar asam amino (2,5 μg) FB = faktor pengenceran ( 133,1 mL)
BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino (g/mol) 3.3.1.4 Analisis asam lemak (AOAC 1984)
Kandungan asam lemak dapat ditentukan dengan metode gas kromatografi didasarkan pada partisi komponen-komponen dari suatu cairan di antara fasa gerak berupa gas dan fasa diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada bahan pendukung inert. Komponen-komponen yang dipisahkan harus mudah menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehingga suhu operasi biasanya lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukan derivatisasi untuk contoh yang sulit menguap. Tahapan analisis asam lemak diawali dengan menghidrolisis lemak/minyak dalam sampel menjadi asam lemak, kemudian ditransformasi menjadi bentuk esternya yang bersifat lebih mudah menguap. Transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil ester asam lemak (FAME). Metil ester asam lemak (FAME) ini dianalisis dengan alat kromatografi gas. Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan
membandingkan waktu retensinya dengan standar pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada saat muncul puncak pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan.
Gambar 7 Prosedur analisis asam amino menggunakan HPLC. Tambelo kering 0,75
Penambahan 5-10 ml HCl 6N Pemanasan dalam oven pada suhu 100 oC selama 24 jam
Hidrolisat Protein Penyaringan dengan milipore
berukuran 45 mikron
Filtrat hidrolisat
Penambahan 30 μL larutan pengering
(campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim dengan perbandingan 2:2:1)
Pengeringan dengan gas N2
Hidrolisat protein kering
Penambahan 30 μL larutan derivatisasi
( campuran antara metanol, pikoiotisianat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4)
Pengenceran dengan buffer asetat sebanyak
200 μL lalu dibiarkan selama 20 menit
Penyaringan dengan milipore berukuran 0,45 mikron
Injeksi ke alat HPLC
29
a. Preparasi contohd (hidrolisis dan esterifikasi)
Contoh lemak ditimbang sebanyak 20-30 mg, kemudia ditambahkan 1 mL larutan NaOH 0,5 N ke dalam metanol dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Sebanyak 2 mL BF3 16% dan 5 mg/mL standar internal ditambahkan pada sampel tersebut, lalu dipanaskan lagi selama 20 menit dan selanjutnya
didinginkan. Sampel kemudian ditambahkan 2 mL NaCl jenuh dan 1 mL n-heksana, lalu dikocok dengan baik. Lapisan heksana dipindahkan dengan
bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi 0,1 gram Na2SO4 anhidrat, dibiarkan 15 menit. Fasa cair dipisahkan dan selanjutnya diinjeksikan ke kromatografi gas.
b. Analisis komponen asam lemak dengan kromatografi gas
Pelarut sebanyak 1 µL diinjeksikan ke dalam kolom. Bila aliran gas pembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan nampak dalam kurang dari 1 menit. Sebanyak 5 µL campuran standar FAME diinjeksikan setelah pena kembali ke nol (baseline). Jika semua puncak sudah keluar, diinjeksikan 5 µL sampel yang telah dipreparasi (A). Waktu retensi dan puncak masing-masing komponen tersebut kemudian diukur. Jika rekorder dilengkapi dengan integrator, waktu retensi dan luas puncak langsung diperoleh dari integrator dan membandingkan waktu retensinya dengan standar untuk mendapatkan informasi mengenai jenis dari komponen-komponen dalam contoh. Jumlah dari masing-masing komponen dalam sampel dihitung menggunakan metode internal standar, dengan cara sebagai berikut :
Keterangan :
Cx = kosentrasi komponen x
Cs = kosentrasi standar internal
Ax = luas puncak komponen x
As = luas puncak standar internal
Kondisi alat kromatografi gas pada saat dilakukan analisis :
1. Kolom : cyanopropil methylsil (kolom kapiler)
2. Dimensi kolom : p=60m,ø dalam = 0.25 mm, 025 µm film tickness
3. Laju alir n2 : 20 ml/menit 4. Laju alir h2 : 30 ml/menit
5. Laju alir udara : 200 – 250 ml/menit 6. Suhu injektor : 200 oc
7. Suhu detektor : 230 oc
8. Suhu kolom : program temperatur
- Kolom temperatur : awal 190 oC diam 15 menit akhir 230 oC diam 20 menit 9. Ratio : 1 : 8
10.Injeksi volum : 1 µl 11. Linier velocity : 20 cm.sec
3.3.1.5 Analisis mineral
Mineral yang dianalisis pada sampel tambelo meliputi mineral kalsium (Ca), kalium (K), magnesium (Mg), besi, (Fe), natrium (Na), mangan (Mn), klorida (Cl), seng (Zn), fospat, dan tembaga (Cu), dianalisis dengan metode spektrofotometer serapan atom (SSA).
a. Analisis mineral kalsium (Ca), kalium (K), dan seng (Zn) (Yosida et al. 1972). Prinsip penentuan kadar kalsium, kalium dan seng adalah proses pelarutan sampel dengan asam klorida, kemudian absorbansinya diukur dengan menggunakan SSA. Prosedur analisis mineral kalsium, kalium dan seng adalah sebagai berikut: Sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram, kemudian dihancurkan dan dimasukkan ke dalam gelas piala yang telah dibilas dengan HCl 1 N. Sampel ditambahkan dengan 25 mL HCl 1 N dan disimpan selama 24 jam. Setelah penyimpanan, sampel dikocok dengan shaker dan disaring dengan kertas Whatman No.1.
1). Analisis mineral kalsium (Ca)
Ekstrak sampel dipipet sebanyak 1 mL, ditambahkan 2 mL larutan lantanum oksida dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 10 mL, kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 mL.
31
Larutan diukur absorbansi dengan SSA pada panjang gelombang 285,2 nm untuk magnesium dan 422,7 nm untuk kalsium.
2). Analisis mineral kalium (K) dan seng (Zn)
Ekstrak sampel dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 40 mL, kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 mL. Larutan diukur absorbansi dengan AAS pada panjang gelombang 766,5 nm untuk kalium dan 213,9 nm untuk seng.
b. Analisis mineral besi (Fe)
Prinsip penentuan kadar besi adalah proses pelarutan bahan dengan larutan asam campur yang terdiri dari asam nitrat, asam sulfat dan asam perklorat, kemudian dilanjutkan dengan proses pemanasan. Prosedur analisis mineral besi adalah sebagai berikut: sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram, kemudian dihancurkan. Larutan asam campuran disiapkan yang dibuat dari HNO3, H2SO4, dan HClO4 dengan perbandingan 5:1:2. Sampel yang telah hancur ditambah 10 mL larutan asam campur lalu dipanaskan di dalam ruang asam menggunakan api kecil selama 2 jam. Api dibesarkan sampai larutan menjadi jernih. Kemudian didinginkan. Larutan ditambahkan akuades sampai volume 50 mL dan disaring dengan kertas saring pencucian asam Whatman No.1 (acid-washed filter paper whatman No.1).
Sebanyak 10 mL ekstrak sampel ditambahkan 1 mL hidroquinon dan 1 mL orto-fenantrolin, kemudian ditambahkan sodium sitrat sampai pH menjadi 3,5. Larutan diencerkan dengan akuades sampai volume 50 mL dan dipanaskan dalam
water bath selama 1 jam. Larutan deret standar diperlakukan dengan pereaksi yang sama dengan ekstrak sampel. Absorbansi diukur dengan SSA pada panjang gelombang 248,3 nm.
c. Analisis mineral tembaga (Cu) dan mangan (Mn) (SNI 01-2362-1991)
Prinsip dari penentuan kadar tembaga dan mangan adalah proses pengabuan dengan suhu 450 oC dengan penambahan asam nitrat (HNO3). Prosedur analisis sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 25 gram dalam gelas piala 250 mL yang terdahulu dicuci dengan HNO3 6N. Sampel dikeringkan di dalam oven pengering pada suhu 110-125 oC selama 8-24 jam. Sample kering kemudian dipindahkan ke dalam tungku, dan atur suhu pada 250 oC. Suhu tunggu
dinaikkan secara bertahap hingga mencapai 350 oC selama periode 1-2 jam. Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya proses pembakaran secara cepat yang menyebabkan contoh dapat terhambur keluar. Kondisi pada suhu ini dibiarkan sesaat untuk memberikan kesempatan sebagian besar lemak terbakar habis. Kenaikkan suhu kemudian dilanjutkan hingga 450 oC, dan dibiarkan selama semalam (16-24 jam). Jika proses sampel abu belum putih sempurna, sampel dikeluarkan dari tungku dan dinginkan. Sampel tersebut kemudian ditambahkan 0,25-1 mL HNO3 pekat. Sampel diletakkan diatas hot plate untuk menguapkan HNO3. Sampel kemudian dipanaskan kembali pada suhu 450 oC di dalam tungku selama 30-60 menit. Abu yang dihasilkan harus benar-benar putih, apabila tidak proses penambahan asam nitrat harus diulangi.
Abu dilarutkan ke dalam 2 mL HNO3 pekat, kemudian diencerkan dengan akuades hingga 25 mL dan didihkan di atas hot plate. Larutan disaring dengan kertas saring Whatman No.42 yang sebelumnya telah dicuci dengan HNO3 10% dan akuades. Filtrat yang diperoleh kemudian diencerkan dengan akuades hingga 50 mL. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam SSA. Absorbansi mineral Cu dan Mn masing-masing diukur dengan SSA pada panjang gelombang 324,7 nm dan Mn 285,2 nm.
3.3.2 Penelitian tahap kedua
Penelitian yang dilakukan pada penelitian tahap kedua adalah ekstraksi bahan aktif, uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan, serta uji fraksinasi dan identifikasi senyawa antioksidan.
3.3.2.1 Ekstraksi bahan aktif
Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi tambelo yaitu tiga macam
pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya, yaitu heksana (non polar), etil asetat (semi polar), dan metanol (polar). Tahapan proses ekstraksi tambelo meliputi
penghancuran sampel, maserasi, partisi, dan evaporasi. Sampel kering ditimbang sebanyak 500 gram, kemudian dimaserasi dengan pelarut metanol (MeOH) sebanyak 2500 mL, perbandingan 1:5 pada suhu ruang selama 3x24 jam. Setiap 1 x 24 jam dilakukan penyaringan, kemudian filtrat yang dihasilkan digabungkan dan dipekat dengan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak MeOH pekat dipartisi dengan n-heksana menggunakan corong pisah diulang sebanyak 3 kali.
33
Sampel (500 g)
Fase n-heksana dikumpulkan dan dipekatkan dan dihitung rendemennya. Ekstrak MeOH setelah partisi n-heksana dipartisi kembali dengan etil asetat, diulang sebanyak 3 kali. Fase etil asetat dikumpulkan dan dipekatkan, lalu dihitung rendemennya. Ekstrak metanol sisa partisi dipekatkan kembali dan dihitung
rendemen. Semua ekstrak diuji fitokimia dan uji antioksidan (Miyaoka et al. 1998; Ebada et al. 2008). Diagram alir proses ekstraksi bahan
aktif tambelo disajikan pada Gambar 8.
Gambar 8 Diagram alir proses ekstraksi bahan aktif tambelo (Ebada et al. 2008).
Ekstrak MeOH
Fase n-heksana
Ekstrak n-Heksana
Dipartisi dengan n-Heksana
Fase MeOH
Fase MeOH Maserasi 3x24 jam dengan MeOH perbandingan 1:5
Penyaringan
Residu Filtrat
Evaporasi
Ekstrak MeOH
Dipartisi dengan etil asetat
Fase etil asetat
Evaporasi Evaporasi
Ekstrak etil asetat
3.3.2.2 Uji fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995) a) Uji alkaloid
Sampel sebanyak 1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL metanol dan beberapa tetes amoniak. Fraksi metanol dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendrof, Meyer, dan Wagner.
b) Uji saponin
Sebanyak 50 mg sampel ditambah dietil eter. Residu yang tidak larut dalam dietil eter diambil, dipisahkan dan ditambahkan 5 ml air kemudian dikocok sampai timbul busa yang stabil.
c) Uji steroid/Triterpenoid
Sampel sebanyak 1 gram ditambahkan 25 mL etanol 30% dipanaskan (50 oC) dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisan eter yang terbentuk dipipet dan diletakkan papan uji (spot plate) dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard (3 tetes asam asetat anhidrin dan 1 tetes H2SO4 pekat), selanjutnya diamati warna yang terbentuk, jika terbentuk warna hijau adalah steroid dan warna merah adalah triterpenoid.
d) Uji Flavonoid
Sebanyak 1 gram sampel ditambah metanol 30% sampai terendam kemudian dipanaskan. Filtratnya ditaruh ke dalam spot plate (papan uji) kemudian ditambahkan H2SO4 pekat, adanya flavonoid ditunjukkan oleh terbentuknya warna merah akibat penambahan H2SO4.
e) Uji Tanin
Sebanyak 50 mg sampel dilarutkan dalam 5 ml etanol ditambah dengan beberapa tetes pereaksi FeCl3 1 %. Adanya tannin ditunjukan dengan terbentuknya warna hijau, biru atau ungu.
f) Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3)
Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang
dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya
35
3.3.2.3 Uji aktivitas antioksidan (Yeh dan Cen 1995)
Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode
perendaman radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl) (Yeh dan Cen 1995). Prinsip kerjanya pada sampel (mengandung senyawa
bersifat antioksidan) yang dapat meredam radikal bebas DPPH. Uji ini dilakukan terhadap ekstrak tambelo. Ekstrak dilarutkan dalam metanol dan dibuat dalam berbagai konsentrasi ( 20, 40, 60, dan 80 ppm), kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ekstrak tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl larutan DPPH 1mM dalam metanol. Volume dicukupkan sampai 5 mL, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Serapan sampel tersebut diukur pada panjang gelombang 515 nm. Butylated hydroxytoluene (BHT) dan vitamin super ester C digunakan sebagai kontrol positif, dan untuk pembanding dengan masing-masing kosentrasi 4, 6, 8, dan 10 ppm. Hambatan dihitung dengan rumus.
Nilai absorbansi sampel diperoleh persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara kosentrasi sampel dan persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Nilai kosentrasi dan hambatan ekstrak diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan regresi yang diperoleh dalam bentuk y = bx + a. Persamaan ini digunakan untuk mencari Inhibition Concentration 50 % (IC50) dengan memasukkan angka 50
sebagai y sehingga didapatkan nilai x sebagai IC50. Pengujian ini dilakukan
sebanyak tiga kali ulangan.
3.3.2.4 Fraksinasi senyawa antioksidan
Fraksinasi terhadap ekstrak kasar tambelo dilakukan pada ekstrak yang