Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Desember 2009 sampai dengan Januari 2011 di laboratorium kultur in vitro kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor (BB-BIOGEN) dan di laboratorium kultur jaringan Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan tanam yang digunakan dalam penelitian ini adalah kuncup bunga jeruk keprok Batu 55 (Citrus reticulata L), jeruk keprok Garut (Citrus reticulata L), Jeruk Siam (Citrus sinensis L) dan jeruk Pamelo (Citrus maxima L). Peralatan yang digunakan adalah Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), autoklaf, mikropipet, alat-alat diseksi (pinset, gunting, dan skalpel), pH meter, botol kultur, peralatan gelas, bunsen dan sprayer.
Metode Penelitian:
1. Studi tahapan perkembangan inti mikrospora antera jeruk
Bahan yang digunakan adalah kuncup bunga jeruk keprok Garut, keprok Batu 55, dan jeruk Siam dengan perbandingan ukuran sepal : petal = kecil (1:2; 1:2,5; 1:3) mm; Sedang (1:4; 2:5; 2:6) mm; dan Besar (2:7; 2:8; 2:9) mm. Pada kuncup bunga jeruk Pamelo mempunyai perbandingan ukuran sepal : petal = kecil (6:10; 6:11; 6:12) mm; Sedang (6:14; 6:15; 6:17) mm; dan Besar (7:19; 7:20; 7:21) mm. Pengamatan mikrospora dilakukan dengan memecah kantung antera, kemudian mikrospora diisolasi dan diletakkan di atas preparat lalu diberi aquadest dua tetes. Penghitungan dilakukan secara mikroskopik dengan perbesaran 400x. Tahap perkembangan mikrospora yang diamati adalah (1) persentase tahap inti tunggal (uninucleate), (2) persentase tahap inti dua (binucleate), dan (3) tidak teramati. Pengamatan mikrospora dilakukan empat kali bidang pandang mikroskop, dan diulang minimal tiga kali untuk setiap ulangan.
2. Studi praperlakuan lama penyimpanan antera terhadap kemampuan induksi kalus jeruk Keprok Garut
Rancangan lingkungan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktor tunggal yaitu praperlakuan penyimpanan pada suhu dingin (10oC) dengan 4 taraf yaitu (1; 3; 5; dan 7) hari. Setiap perlakuan terdiri dari 5 ulangan, dan setiap botol merupakan satu ulangan, dimana dalam satu botol berisi 10 antera. Pengamatan dilakukan sampai minggu ke-8.
Kuncup bunga jeruk Keprok Garut yang mempunyai tahapan perkembangan inti mikrospora uninukleat yang tinggi, dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditutup dengan aluminium foil, lalu tabung reaksi dimasukkan ke dalam botol yang telah berisi air dan dimasukkan dalam lemari pendingin (10oC) sesuai dengan perlakuan. Antera kemudian diisolasi dari kuncup bunga dan ditanam pada media dasar Murashige dan Tucker (MT) yang ditambahkan 10 mg/l pikloram. Peubah yang diamati dalam percobaan ini adalah: jumlah antera yang membesar / membengkak dan jumlah antera yang menghasilkan kalus.
3. Induksi kalus pada antera jeruk Keprok Batu 55, jeruk Siam dan jeruk Pamelo
Antera jeruk Keprok Batu 55, jeruk Siam dan jeruk Pamelo yang telah mendapatkan praperlakuan dingin (10oC) terbaik (5 hari) ditanam pada berbagai komposisi media induksi kalus.
3.1 Jeruk keprok Batu 55
Rancangan yang digunakan adalah RAL faktor tunggal yaitu perlakuan jenis media dengan 3 taraf yaitu; (1) Padat; (2) Padat + Cair; (3) Cair. Setiap perlakuan terdiri atas 14 ulangan dimana setiap botol merupakan satu ulangan dan dalam satu botol berisi 8 antera. Komposisi media yang digunakan adalah media dasar MT + 3 mg/l BAP + 500 mg/l ekstrak malt. Media dipadatkan dengan phytagel 2 g/l kecuali media cair, pH media diatur pada 5,8. Kultur diinkubasi pada ruang gelap. Sub kultur dilakukan dua kali dalam sebulan sampai 4 kali sub kultur pada media yang sama. Peubah yang diamati dalam percobaan ini adalah: jumlah antera yang membengkak, dan jumlah antera yang menghasilkan kalus.
3.2 Jeruk Siam
Rancangan lingkungan yang digunakan adalah RAL faktor tunggal yaitu perlakuan 2,4-D dengan 3 taraf yaitu: 3mg/l, 5 mg/l, dan 7 mg/l. Setiap perlakuan terdiri dari 15 ulangan dimana setiap botol merupakan satu ulangan dan dalam satu botol berisi 7 antera. Antera jeruk Siam ditanam pada media dasar MT + 500 mg/l ekstrak malt. Media dipadatkan dengan phytagel 2 g/l, pH media diatur pada 5,8 dan diinkubasi pada ruang gelap. Sub kultur dilakukan dua kali dalam sebulan sampai 4 kali sub kultur pada media yang sama. Peubah yang diamati dalam percobaan ini adalah: jumlah antera yang membengkak, dan jumlah antera yang menghasilkan kalus.
3.3 Jeruk Pamelo
Rancangan lingkungan yang digunakan adalah RAL faktor tunggal yaitu perlakuan media (3 mg/l BAP dan NAA) dengan 3 taraf yaitu: (1) 1 mg/l NAA; (2) 2 mg/l NAA; (3) 3mg/l NAA. Setiap perlakuan terdiri dari 15 ulangan dimana setiap botol merupakan satu ulangan dan dalam botol berisi 5 antera. Antera yang ditanam adalah antera yang mengandung mikrospora dengan inti tunggal tinggi dan telah mendapatkan praperlakuan dingin (10oC) diinduksi pada media dasar MT + kombinasi (3 mg/l BAP dan NAA) + 500 mg/l ekstrak malt. Semua perlakuan media dipadatkan dengan phytagel 2 g/l kecuali media cair, pH media diatur pada 5,8 dan diinkubasi pada ruang gelap. Sub kultur dilakukan dua kali dalam sebulan sampai 4 kali sub kultur pada media yang sama.
Semua hasil penelitian (studi praperlakuan lama penyimpanan pada antera jeruk keprok Garut, induksi kalus pada jeruk keprok Batu 55 dan jeruk Siam serta jeruk Pamelo) dianalisis dengan menggunakan analisis ragam (uji F) pada taraf nyata (α) 5% dengan bantuan program SAS 9.1. Apabila hasil uji nyata, dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan (Duncan’s Multiple Range Test- DMRT).
Analisis Kromosom
Jumlah kromosom kalus jeruk dianalisis dengan menggunakan Metode Pra-perlakuan Lengkap (Sastrosumarjo 2006). Kalus dimasukkan kedalam botol yang berisi larutan 8-Hydroxyquinolin 0,002 M. Botol dimasukkan ke dalam lemari pendingin (4oC) selama 90 menit, lalu kalus dikeluarkan dan dicuci dengan air. Kalus yang telah dicuci dengan air, direndam dalam asam asetat 45% selama 10 menit kemudian dimasukkan dalam botol berisi campuran HCl dengan asam asetat 45% perbandingan 3:1 selama 2 menit, lalu dipanaskan dalam waterbath dengan suhu 60oC selama 2 menit.
Kalus dipindahkan ke gelas arloji, kemudian diteteskan aceto orcein 2% dan biarkan selama 10 menit. Kalus diletakkan pada gelas objek, kemudian diberikan 2 tetes aceto orcein 2% lalu ditutup dengan gelas penutup. Preparat dilewatkan di atas api bunsen 2-3 kali kemudian preparat diketuk dengan pensil berkaret (squash), lalu ditekan dengan ibu jari. Preparat siap diamati dibawah mikroskop.