Waktu dan Tempat
Penelitian ini dimulai bulan Maret 2009 sampai dengan bulan April 2011. Penelitian dilakukan di Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium South East Asian Food &
Agricultural Science & Technology (SEAFAST) Centre IPB serta Laboratorium pendukung seperti Labotarorium Balitnak Kementerian Pertanian dan Laboratorium Biorin-Bioteknologi IPB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan meliputi: otoklaf, mikroskop polarisasi (Olympus C-35AD-4 Japan), spektrofotometer, difraksi sinar X (Shimadzu XRD-7000 Maxima), gas kromatografi (Chrompack CP 9002 seri 946253), anoxomat,
anaerobic jar, sentrifuse, elektroforesis, UV transilluminator, alat PCR PTC 100 (MJ Research, Inc), inkubator, otoklaf, oven dan lain sebagainya.
Bahan baku yang digunakan adalah pisang var agung semeru (Musa paradisiaca formatypica) yang diperoleh dari Kecamatan Senduro Kabupaten Lumajang Propinsi Jawa Timur. Buah pisang tua mentah dipanen pada minggu ke 16 dari awal pembungaan.
Media dan bahan kimia yang digunakan antara lain: de Mann Rogosa Sharp Agar (MRSA) dan de Mann Rogosa SharpBroth (MRSB), Brain Heart Infusion
(BHI) agar, Thioglycollate agar,kristal violet, lugol, safranin, alkohol, NaCl, asam tartarat 10%, gliserol, NaOH, buffer fosfat, buffer TAE, Na2HPO4.2H2O,
NaHPO4, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, DNS, HCl, K2HPO4, MgSO4.7H2O,
CaCl2.2H2O, NaHCO3, bacto agar, L-cysteine HCl, garam bile, resazurin, vitamin
K1, Tween 80, hemin, Kit API 50CH, CTAB, PCI, primer universal 63F dan 1387R KI2, enzim pankreatin, pepsin dan amiloglukosidase.
Tahap Penelitian
Penelitian meliputi empat tahap yaitu: 1) proses modifikasi secara fermentasi spontan serta kombinasinya dengan satu dan dua siklus pemanasan bertekanan yang dilanjutkan dengan pendinginan, 2) identifikasi fenotip dan genotip bakteri asam laktat (BAL) asal fermentasi spontan pisang var agung semeru, 3) proses modifikasi secara fermentasi oleh isolat BAL indigenus dan kombinasinya dengan siklus pemanasan bertekanan-pendinginan dalam pembuatan tepung pisang kaya RS, 4) isolasi pati resisten (RS) serta evaluasi sifat prebiotik dan nilai indeks glikemik tepung pisang.
Modifikasi Pembuatan Tepung Pisang secara Fermentasi Spontan dan Kombinasinya dengan Siklus Pemanasan Bertekanan-Pendinginan
Proses modifikasi dilakukan pada irisan pisang yaitu pisang diiris dengan ketebalan ± 5mm. Irisan pisang diberi perlakuan fermentasi spontan yang dilanjutkan dengan satu atau dua siklus retrogradasi yaitu pemanasan bertekanan yang diikuti pendinginan. Proses pemanasan bertekanan dilakukan dengan menggunakan otoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit yang kemudian didinginkan pada suhu 4 oC selama 24 jam. Tepung pisang kontrol disiapkan tanpa modifikasi yaitu pisang diiris dengan ketebalan ± 5mm dan dikeringkan pada suhu 50 oC selama 16 jam selanjutnya dihaluskan serta diayak dengan ayakan 80 mesh.
Tepung pisang modifikasi secara fermentasi spontan yang dikombinasi dengan retrogradasi disiapkan dengan merendam irisan pisang dalam akuades steril (3:4) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Selama fermentasi dilakukan pengukuran total bakteri asam laktat, pH dan total asam laktat tertitrasi pada jam ke-0, 12 dan 24 jam. Pada jam ke-24 pisang ditiriskan. Untuk modifikasi fermentasi spontan maka irisan pisang terfermentasi dapat langsung dikeringkan pada suhu 50 oC selama 16 jam serta dihaluskan dan diayak dengan ayakan 80 mesh. Untuk modifikasi fermentasi spontan yang dikombinasi dengan
siklus pemanasan bertekanan-pendinginan maka irisan pisang terfermentasi diberi perlakuan satu dan dua siklus pemanasan bertekanan-pendinginan. Perlakuan diulang sebanyak dua kali dengan dua kali ulangan teknik sampling bahan baku di lahan budidaya pisang var agung semeru.
Keenam jenis tepung pisang yang dihasilkan selanjutnya dianalisis komposisi kimia yang meliputi proksimat (air, protein, lemak, mineral dan karbohidrat) dengan menggunakan metode AOAC (1999), kadar pati dan kadar amilosa (AACC 2000), pati cepat tercerna (rapidly digestible starch/RDS), pati lambat tercerna (slowly digestible starch/SDS), pati resisten (resistant starch/RS) (Englyst et al. 1992), serta daya cerna (AACC 2000). Karakterisasi fisik seperti bentuk granula pati dan tingkat kristalinitas tepung pisang juga dievaluasi pada tepung pisang kontrol dan tepung pisang modifikasi yang banyak mengandung pati resisten.
Identifikasi Fenotip dan Genotip Bakteri Asam Laktat Asal Fermentasi Spontan Pisang var Agung Semeru
Selama fermentasi spontan 24 jam diketahui populasi bakteri asam laktat (BAL) tumbuh dominan. Oleh karena itu dilakukan identifikasi BAL yang berperan selama fermentasi. Identifikasi fenotip berdasarkan sifat Gram positif, katalase negatif, bentuk sel kokus atau batang dengan bentuk/tipe koloni tertentu (Ammor et al. 2005). Selanjutnya isolat diinokulasikan dalam media MRS cair dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam untuk diidentifikasi lanjut atau disimpan dalam larutan gliserol (30% v/v) pada suhu -20 oC. Sifat fermentatif isolat BAL dianalisis dengan menggunakan kit API 50CHL.
Identifikasi genotip dilakukan dengan menggunakan metode PCR dan sekuensing DNA pengkode 16S rRNA. DNA isolat BAL diekstraksi dengan menggunakan metode Thompson et al. (1995).
Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan alat PCR PTC 100 (MJ Research, Inc) pada suhu 95 oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94 oC selama 30 detik kemudian 30 siklus penempelan primer pada suhu 50 oC selama 1 menit, 72 oC selama 2 menit, dan tahap akhir pasca sintesis
pada suhu 72 oC selama 5 menit dan 15 oC selama 10 menit. Produk PCR diambil dan disimpan pada suhu 4 oC untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan elektroforesis agarosa 1% b/v dalam TAE 1x, 100 V selama 30 menit (Sambrook dan Russel 2008;Suharsono dan Widyastuti 2008). Pensejajaran ganda (multiple alignment) dilakukan dengan menggunakan Program Clustal W yang selanjutnya divisualisasikan kekerabatannya menggunakan pohon filogenetik Program TREEVIEW X yang dikombinasikan dengan Program NJ-Plot (Thompson et al. 1995).
Modifikasi Secara Fermentasi Terkendali oleh Isolat BAL Indigenus dalam Pembuatan Tepung Pisang Modifikasi Kaya RS
Irisan pisang dan akuades steril dalam perbandingan 3:4 diinokulasi dengan isolat BAL homofermentatif indigenus sehingga populasi kultur mencapai jumlah 106 CFU/ml. Selanjutnya pisang diinkubasi selama 12 dan 24 jam pada suhu kamar. Pisang ditiriskan dan diberi proses dua siklus pemanasan bertekanan- pendinginan yaitu pemanasan bertekanan dengan menggunakan otoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit kemudian dilanjutkan dengan pendinginan pada suhu 4
o
C selama 24 jam. Proses pengeringan dilakukan pada suhu 50 oC selama 16 jam, selanjutnya chip dihaluskan serta diayak dengan menggunakan ayakan 80 mesh.
Evaluasi Sifat Prebiotik dan Indeks Glikemik (IG) Tepung Pisang
Evaluasi sifat prebiotik dilakukan pada RS2 dari tepung pisang yang tidak mengalami retrogradasi dan RS3 dari tepung pisang yang mengalami retrogradasi. RS diisolasi dengan menggunakan metode Englyst et al. (1992) yang dimodifikasi dengan metode gravimetri (AOAC 1999). Sifat prebiotik dianalisis berdasarkan ketahanan RS terhadap cairan lambung artifisial pada pH 1 sampai 5 (Wicheinchot et al. 2010), persentase pertumbuhan probiotik (Lactobacillus acidophilus) dan bakteri patogen, yaitu enteropatogenik Escherichia coli (EPEC) dan Salmonella Typhimurium (Buriti et al.2010) serta fermentasi RS oleh kultur
feses untuk mengetahui kemampuan memodulasi mikroflora dan menstimulasi produksi asam lemak rantai pendek (short chain fatty acid/SCFA) serta nilai indeks prebiotik (Manderson et al. 2005).
Evaluasi IG dilakukan pada keenam jenis tepung pisang yang dihasilkan. Uji IG tepung pisang dilakukan dengan menggunakan sepuluh relawan manusia (Astawan & Widowati 2011). Tepung pisang disajikan kepada relawan dalam bentuk nasi yang diolah seperti menanak tiwul. Pengujian ini sudah mendapat persetujuan etis (ethical approval) dari Kementerian Kesehatan dengan No. LB.03.04/KE/8320/ 2010.
DAFTAR PUSTAKA
[AACC] American Association of Cereal Chemists. 2000. Approved Methods of the AACC. The Association, St. Paul, MN. 10th ed.
Ammor S, Rachman C, Chaillou S, Prevost H, Dousset X, Zagorec M, Dufour E, Chevalliera I. 2005. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from a small-scale facility producing traditional dry sausages. J Food Microbiol. 22: 373–382
[AOAC] Association of analytical communities. 1999. Official Methods of Analysis of AOAC International16th. USA.
Astawan M, Widowati S. 2011. Evaluation of nutrition and glycemic index of sweet potatoes and its appropriate processing to hypoglycemic foods.
Indonesian J Agricultural Science. 12 (1)
Buriti FCA, Castro IA, Saad SMI. 2010.Viability of Lactobacillus acidophilus in synbiotic guava mousses and its survival under in vitro simulated gastrointestinal conditions. Int J Food Microbiology. 137: 121–129.
Englyst HN, Kingman SM, Cummings JH. 1992. Classification and measurement of nutritionally important starch fraction. European J Clinical Nutr. 46(Suppl.2): 533-550.
Manderson K, Pinar M, Tuhoy KM, Race WE, Otckiss AT, Widmer W, Yadhav MP, Gibson R, Rastall RS. 2005. In vitro determination of prebiotic properties of oligosaccharides derived from an orange juice manufacturing by-product stream. App and Env Microbiol. 71 (12): 8383-8389,
Suharsono, Widyastuti U. 2008. Penuntun Praktikum; Pengantar Genetika Molekuler. Departemen Biologi-FMIPA. Institut Pertanian Bogor
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1995. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, Position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res. 22: 4673-4680.
Wichienchot S, Jatupornpipat M, Rastall RA. 2010. Oligosaccharides of pitaya (dragon fruit) flesh and their prebiotic properties. Food Chem. 120: 850– 857.