3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Farmasi yaitu Laboratorium Penelitian II, Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, Laboratorium Penelitian I, dan Laboratorium Kesehatan Lingkungan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatulah Jakarta. Penelitian dimulai bulan Januari hingga April.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
KCKT (Dionex Ultimate 3000) yang terdiri dari: pompa (Dionex Ultimate 3000 pump), kolom AcclaimTM 1200 C18 5µm 4,6x250mm,
autosampler, detektor DAD (Diode Array Detector), program komputer PC (Chromeleon). Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel (Hitachi U-2910), Ultrasonic Bath (Branson 5510), pH meter (Horiba), magnetic stirer
(Wiggen Hauser), vorteks, sentrifugator dan tabung sentrifugasi (Eppendorf Centrifuge 5417 R), timbangan analitik, alat-alat gelas, mikropipet, dan lemari pendingin.
3.2.2 Bahan
Standar Analitik Losartan Potassium (Sigma-Aldrich), Tablet Kalium Losartan, Asetonitrile (Merck), Metanol (Merck), KH2PO4, Aquabidest, Aquadest.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Pembuatan Larutan Induk Kalium Losartan
Ditimbang sebanyak 50,0 mg Kalium Losartan. Dilarutkan ke dalam metanol HPLC grade hingga volume akhir 50 mL lalu didapat konsentrasi 1000µg/mL yang digunakan sebagai larutan induk.
18
3.3.2 Penetuan Panjang Gelombang Maksimum
Dibuat spektrum serapan ultraviolet Kalium Losartan dengan melakukan pengenceran larutan induk Kalium Losartan dalam methanol
HPLC grade hingga didapat konsentrasi 10ppm. Atur spektrum pada panjang gelombang 200-400nm menggunakan Spektrofotometer UV-Visibel, lalu ditentukan panjang gelombang maksimumnya.
3.3.3 Penetapan Kondisi Optimum
Sesuai dengan USP 30 kondisi optimum yang digunakan untuk menganalisis Kalium Losartan sebagai berikut:
Fase Gerak : Asetonitril : 0,1% asam fosfat dalam air (2:3 v/v) Fase Diam : Kolom C18 (5µm 4,6x250mm)
Laju alir : 1mL/min Temperatur Kolom : 35 °C Volume Injeksi : 10µ L
a. Pembuatan 0,1% Asam Fosfat dalam Air
0,1% Asam fosfat dalam air dibuat dengan melarutkan 1mL asam ortofosfat pekat dalam aquabides, lalu ad hingga 1000mL.
b. Pembuatan Dapar Fosfat pH 2 dan pH 3
Dapar fosfat dibuat masing-masing dengan melarutkan KH2PO4
0,34gr ke dalam 40mL aquades, cek dengan pH meter, adjust dengan asam ortofosfat hingga didapatkan pH 3 dan pH 2, lalu ad hingga 50ml dengan aquades.
c. Preparasi Sediaan
Sediaan Kalium Losartan dalam bentuk tablet sebanyak 20 buah dikeluarkan dari strip, digerus lalu ditimbang berat totalnya, kemudian dilakukan perhitungan setara 50,0 mg Kalium Losartan lalu ditimbang sebanyak 4 kali untuk dibagi menjadi 4 sampel (pH 7 tidak terlindung, pH 4 tidak terlindung, pH 7 terlindung, dan pH 4 terlindung). Untuk kondisi terlindung semua wadah yang digunakan dilindungi menggunakan alumunium foil dan dihindarkan dari cahaya, sedangkan untuk kondisi asam ditambahkan dapar fosfat hingga didapat pH 4.
19 Masing-masing serbuk yang telah ditimbang setara 50,0 mg Kalium Losartan dilarutkan menggunakan aquadest ad 50 mL hingga didapat kadar 1000 µg/mL. Sebelum pengukuran kadar, ambil cuplikan Kalium Losartan sebanyak 150µ L lalu dilakukan pengenceran dengan menambahkan 1,2 mL metanol HPLC grade dan 150µL dapar fosfat hingga didapat konsentrasi 100 µg/mL dengan pH sediaan 5,5.
3.3.5 Uji Kesesuaian Sistem
Larutan Kalium Losartan dibuat dengan melakukan pengenceran larutan induk Kalium Losartan hingga didapat konsentrasi 100ppm, diinjeksi sebanyak 10µ L ke alat KCKT dengan fase gerak 0,1% asam fosfat dalam air : asetonitril 3:2 (v/v), diulangi sebanyak enam kali. Kemudian dihitung jumlah plat teoritis, % RSD (Relative Standard Deviation) Peak Area & Retention Time, dan faktor tailing.
3.3.6 Verifikasi Metode 3.3.6.1 Akurasi
Uji akurasi dilakukan pada konsentrasi 80, 100, dan 120ppm. Dibuat larutan Kalium Losartan dengan melakukan pengenceran larutan induk Kalium Losartan dalam methanol HPLC grade hingga didapat konsentrasi 80, 100, dan 120ppm. Larutan di suntikan sebanyak tiga kali masing-masing 10,0µ L ke alat KCKT dengan fase gerak 0,1% asam fosfat dalam air:asetonitril 3:2 (v/v) dan laju alir 1mL/menit. Dihitung nilai % perolehan kembali (%recovery) dan % differensiasi.
3.3.6.2 Presisi
Uji presisi dilakukan pada kadar sebesar 80ppm, 100ppm, dan 120ppm. Dibuat larutan Kalium Losartan dengan melakukan pengenceran larutan induk Kalium Losartan dalam methanol HPLC grade hingga didapat konsentrasi 80, 100, dan 120ppm.
20 Larutan di suntikan sebanyak tiga kali masing-masing 10,0 µ L ke alat KCKT dengan fase gerak 0,1% asam fosfat dalam air : asetonitril 3:2 (v/v) dan laju alir 1mL/menit. Uji presisi dilakukan pada intrahari dan interhari. Pada uji interhari proses injeksi dilakukan pada jam ke-0 dan 6. Sedangkan pada uji intrahari uji dilakukan pada hari ke-1 dan 2. Dihitung nilai SD dan RSD.
3.3.7 Penetapan Kurva Kalibrasi
Seri konsentrasi Larutan Kalium Losartan diencerkan hingga didapatkan konsentrasi 25, 50, 75, 100, 125 dan 150ppm. Sebanyak 10 µ L dari larutan tersebut diinjeksikan ke alat KCKT sesuai metode USP 30. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap konsentrasi Kalium Losartan dari masing-masing konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasinya.
LOD dihitung melalui persamaan garis regresi linier dari kurva kalibrasi dengan rumus:
LOQ=
Sedangkan LOD didapatkan melalui rumus: LOD=
Dimana (Sy/x) adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari persamaan regresi.
3.3.8 Analisis Degradasi Kadar
Tabel 3.1 Sampel Uji
Sampel Uji pH 7 pH 4
Cahaya normal pH 7 tidak terlindung pH 4 tidak terlindung Terlindung Cahaya pH 7 terlindung pH 4 terlindung
Keterangan: Terlindung = wadah dilapisi alumunium foil dan dilakukan dalam kondisi gelap.
21 Dilakukan rangkaian pengujian berdasarkan waktu, yaitu pengujian pada menit ke-0, 15, 30, 45, dan 60. Suspensi yang telah siap, dihomogenkan dengan cara dikocok sebanyak 20x, ambil cuplikan dari masing-masing sampel sebanyak 150µ L lalu diencerkan dengan 1,2 mL metanol HPLC grade dan 150µ L dapar fosfat hingga didapat pH sediaan 5,5 dengan konsentrasi 100 µg/mL, sampel tersebut menjadi sampel uji menit ke-0. Untuk sampel uji menit ke-15, 30, 45, dan 60 diamkan suspensi hingga waktu 15, 30, 45, dan 60 lalu homogenkan degan cara dikocok 20x dan lakukan seperti tahapan di atas.
Selanjutnya setiap sampel divortex selama 5 menit. Kemudian disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm dengan suhu 25oC. Supernatan yang didapatkan kemudian diambil dan disaring dengan menggunakan srynge filter 0,45 lalu dimasukkan ke dalam vial untuk dilakukan pengukuran KCKT sesuai dengan USP 30. Hitung luas area puncak utama lalu dicari konsentrasinya menggunakan persamaan regresi yang didapat.
22
BAB IV