BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.2 Merokok
2.2.4 PAH sebagai Zat Karsinogenik Kuat dalam Rokok
PAH dapat didefinisikan sebagai suatu kelompok senyawa kimia yang memiliki dua atau lebih cicin benzena yang terdapat didalamnya tetapi tidak bersifat heteroatom dan merupakan suatu zat karsinogen kuat (Hecht, 2002).
Paparan PAH melalui inhalasi dapat menyebabkan seseorang berisiko mengidap kanker paru (Osgood et al, 2013). Didalam 1 gram tembakau terdapat lebih dari 100 ng PAH tanpa melihat merek rokok, lebih kurang 0,26µgr BaP ikut terinhalasi dalam setiap 1 pak rokok yang dihisap ( Picardo et al, 2010)
Sifat karsinogenik dari PAH berkaitan dengan struktur molekulnya yang kompleks seperti, semakin banyak cincin benzene semakin tinggi sifat karsinogeniknya. Menurut IARC (2012) ada terdapat paling sedikit 11 jenis PAH yang karsinogenik terhapadap manusia atau berpotensi menjadi karsinogen antara lain: membran sel dengan mudah melaui difusi aktif setelah terinhalasi. Transformasi senyawa-senyawa ini melibatkan banyak enzim metabolisme dan telah diketahui tiga jalur utama yaitu: jalur Cytochrom (Cyp) 1A1/1B1 dan EPHX1 (Cyp/EH pathway), jalur Cyp Peroxidase, dan jalur Aldo-Keto-Reduktase (AKR pathway) . Biasanya PAH akan dimetabolisme oleh enzim Cyp dan enzim metabolisme lainnya menjadi fenol, katekoldan quinone yang akan menghasilkan suatu bentuk epoxide diol, kation radikal atau bentuk quinon yang reaktif yang akan bereaksi
dengan DNA sehingga menghasilkan DNA adduct. Quinon akan bereaksi dengan gugus N-7 dari basa guanin dan N-3 dari basa adenin pada DNA (Liu, 2002 dalam Morthy 2015).
Terbentuknya DNA adduct akan menyebabkan kesalahan dalam replikasi DNA baik dalam hal metilasi pada promoter dan atau pengikatan dengan promoter yang mengakibatkan terjadinya kemungkinan mutasi DNA atau kesalahan dalam ekspresi gen dan akhirnya dapat menyebabkan terjadinya tumorigenesis (Yang et al, 2012). Metabolit reaktif dari PAH juga dapat bereaksi dengan protein dari sel sehingga membentuk protein adduct, sehingga merusak aktifitas normal dari protein tersebut (Kafferlein et al, 2010).
Gambar 2.1 Struktur Kimia PAH (Morthy,2015)
Metabolit dari PAH juga dapat memicu peningkatan Reative Oxygen Species (ROS) yang secara langsung akan merusak DNA, lemak, atau protein lainnya serta menjadi awal mula proses karsinogenesis (Kwack and Lee, 2000).
Diantara berbagai jenis PAH tersebut yang telah banyak diketahui sebagai karsinogen terhadap manusia adalah BaP dan telah banyak penelitian dilakukan untuk membuktikan sifat karsinogeniknya. BaP didalam tubuh akan diubah menjadi BP 7,8 epoxide oleh enzim CYP1A1 melalu jalur CYP/EPHX1. BP 7,8 epoxide kemudian dioksidasi oleh EPHX1 menjadi 7,8 dihidrodiol yang kemudian akan melewati langkah terakhir menjadi BP 7,8 dihidrodiol 9,10 epoxide (BPDE) oleh enzim CYP1A1 (Morthy et al, 2015).
Gambar 2.2 Skema metabolisme BaP (Morthy, 2015)
Terbentuknya BPDE menjadi karsinogen melewati tiga reaksi enzimatis antara lain:
Reaksi pertama yaitu BaP akan dioksidasi oleh enzim CYP1A1 yang akan menjadi berbagai metabolit, salah satunya adalah BP 7,8 epoxide
Reaksi berikutnya adalah dengan membuka cincin epokside dari BP 7,8 epokside oleh enzim EPHX1 sehingga akan terbentuk BP 7,8 diol
Kemudian BP 7,8 diol ini akan mengalami reaksi kembali dengan CYP1A1 membenruk karsinogen yang utama yaitu BPDE, yang akan bereaksi secara kovalen dengan DNA.
BaP akan merangsang aktivasi dari CYP melalui ikatannya dengan Aryl Hidrocarbon Resecptor (AhR) yang terdapat di sitosol. AhR diekspresikan hampir diseluruh jaringan, yang paling tinggi terdapat pada jaringan hepar, jaringan adiposa dan sel epitel bronkus. AhR adalah salah satu fakor transkripsi yang secara normalnya terikat pada kompleks protein inaktif didalam sitosol (Morthy et al, 2015).
Ikatan PAH dengan reseptornya akan menyebabkan terlepasnya suatu komponen penting yaitu Hepatitis B virus X associated Protein 2 dari kompleks AhR, sehingga AhR ini akan terlepas masuk ke dalam nukleus. Di dalam nukleus akan terjadi dimerisasi antara AhR dengan AhR Nuclear Translocator (ARNT).
Bentuk heterodimer AhR/ARNT inilah bentuk aktif dari faktor transkripsi yang kemudian akan dikenali oleh AhR Responsive Elemens (AHREs) pada daerah promoter gen yang berkaitan dengan AhR (Morthy et al, 2015).
BPDE akan bereaksi dengan DNA sehingga akan menyebabkan terjadinya DNA Adduct, sehingga enyebabkan mutasi pada gen seperti pada p53 dan KRAS onkogen. Telah dilaporkan akibat terbentuknya DNA adduct pada kodon 157, 258 dan 273 sehingga terjadi mutasi gen p53 menyebabkan terjadinya kanker paru pada manusia. Hal ini telah diidentifikasi bahwa sejumlah tempat pada gen p53 seperti pada kodon 157, 158, 245, 248 dan 273 merupakan tempat ikatan dengan BPDE. Selain dari P53, BPDE juga menyebabkan muatasi pada gen KRAS.
Mutasi tersebut paling sering terjadi pada kodon 12 (hampir pada 85% kasus), sehingga menyebabkan perubakan basa G menjadi T (Panov, 2005).
2.2.4.1 Hubungan Metabolit aktif dari PAH dengan mekanisme terjadinya kanker Paru
BaP akan mengalami metabolisme oleh serangkain reaksi metabolisme xenobiotik menjadi suatu metabolit aktif yaitu BPDE. BPDE akan berikatan dengan DNA membentuk deoxiguanoside-DNA, yang bersifat sangat reaktif dan membentuk ikatan kovalen dengan DNA menyebabkan misreplikasi dan mutasi.
Apabila DNA Adduct dapat diperbaiki oleh enzim seluler selama fase siklus sel maka DNA tersebut dapat kembali ke fungsi normalnya. Tetapi apabila proses tersebut gagal dan terus dilanjutkan ke fase replikasi DNA, maka akan terjadi
kegagalan dalam pengkodean DNA dan cenderung untuk menjadi mutasi yang permanen. Sel-sel dengan DNA yang telah rusak tersebut dapat dilisiskan melalui proses apoptosis. Apabila mutasi tersebut terjadi pada gen P53 ataupun Ras protonkogen dapat menyebabkan hilangnya kontrol pertumbuhan sel, dan mengawali terjadinya pertumbuhan tumor (Zakaria,2014). Mutasi pada gen P53 akan mempengaruhuran siklus sel normal sehingga mengakibatkan hilangnya rem laju pertumbuhan. Jika mutasi tersebut pada KRAS protoonkogen meningkatkan fungsi onkogen sehingga akan mengaktifkan protein-protein lain dalam kaskade transduksi sinyal yang kemudian menghasilkan pembelahan sel (Hecht, 1999).
Gambar 2.3 Skema mekanisme terjadinya Kanker Paru (Morthy et al, 2015)
Gambar 2.4 Skema Bahan Kimia Rokok menyebabkan Kanker Paru (Hecht, 1999)
KRAS protoonkogen adalah suatu protein intraseluler yang berperan dalam pengaturan sinyal pertumbuhan. Protein Tirosin Kinase yang telah diaktifkan akan berikatan dengan dengan Ras melaui adaptor Grb2 dan protein Sos, yang langsung mengaktifkan Ras dengan mengubah GDP menjadi GTP. Ras kemudian akan mengaktifkan Jalur Raf-Ras-MAP-Kinase sehingga akan menyebabkan terjadinya transformasi sel (Zakaria, 2014).
2.3 Microsomal epoxide hydrolase (EPHX1)
EPHX1 pertama kali diisolasi dari jaringan hati manusia oleh Oesch pada tahun 1974. EPHX1 diekpresikan hampir diseluruh jaringan tetapi konsentrasi yang paling tinggi dapat dijumpai pada hepar, gonad, ginjal dan sel epitel bronkus. Terdapat lima kelas EPHX yang telah diketahui namun yang paling utama yang berperan dalam metabolisme xenobiotik dengan berbagai macam substrat yang spesifik adalah EPHX1. Pada manusia terdapat dua jenis EPHX1 yaitu mikrosomal EPHX dan soluble EPHX. Enzim yang terdapat pada retikulum endoplasma didalam sel sehingga enzim ini disebut sebagai mikrosomal epoksid hidrolase (Erkisi, 2010).
Gen yang mengkodekan EPHX1 berada pada kromosom 1 (1q42.12), yang terdiri dari 9 ekson dengan ukuran 35 kb yang akan mentranslasikan 455 asam amino.
EPHX1 mengkatalisis reaksi hidolisis senyawa epoksida reaktif menjadi bentuk senyawa transdihidrodiol. Epoksida reaktif ini adalah suatu senyawa kimia yang sangat reaktif yang bersifat tidak stabil didalam air. Epoksida reaktif dapat berasal dari oksidasi metabolisme xenobiotik dan senyawa kimia endogen yang berasal dari metabolisme enzim CYP450 mononksigenase. Metabolit epoksida ini
bersifat mutagenik dan karsinogenik. Melalui reaksi hidrolisi yang di katalisator oleh EPHX1, metabolit epoksida menjadi lebih stabil dan tidak reaktif (Pinarbasi,2010).
EPHX1 adalah golongan enzim α/β hydrolase, dimana inti α/β hidrolasenya menghubungkan gugus N terminal dan C terminalnya. N terminal berfungsi sebagai membran pengikat dan gugus C terminal sebagai tempat katalitiknya. Enzim ini memiliki struktur yanng padat sehingga membuat enzim ini tahan terhadap proses inaktifasi oleh suhu. Diketahui ada dua tahap reaksi kimia dari aktifitas enzim ini, pertama EPHX1 dengan substrat epoksida akan membentuk metabolit ester , setelah itu baru dihidrolisis menjadi dihidrodiol (El-Sherbeni, 2014)
Fungsi pertama EPHX1 yang telah diketahui adalah detoksifikasi epoksida yang bersifat genotoksik. Epoksida adalah suatu bentuk eter siklik dengan cincin yang memiliki tiga anggota. Struktur dasarnya terdiri dari satu atom oksigen yang diikat pada dua atom karbon yang berdekatan yang berasal dari hidrokarbon. Tegangan dari cincin dengan tiga anggota ini yang menyebabkan senyawa ini lebih reaktif dibandingkan dengan eter asiklik. Epoksida dapat diperoleh dari hasil metabolisme senyawa aromatik atau alkena oleh enzim metabolisme xenobiotik CYP 450 atau masuk ke dalam tubuh melalui polusi lingkungan seperti asap rokok. Epoksida tersebut merupakan senyawa elektropilik yang cukup reaktif yang secara kimia dapat menyerang struktur elektron pada asam nukleat sehingga menyebabkan terjadinya DNA adduct. DNA adduct akan menyebabkan terjadinya mutasi gen dan jika terjadi pada gen penekan tumor atau protoonkogen, dapat mengawali terbentuknya tumor (Arand, 2005).
EPHX1 memiliki tempat aktif yang terdiri dari 3 kompenen katalitik yang terdiri dari His 431, Asp 226, dan Glu404 dan ditambah dengan dua residu tirosin, komponen penting untuk membantu tiga komponen katalitik tersebut. EPHX1 mengenali substratnya dan diletakkan ke dalam tempat aktif oleh residu tirosin.
Residu tiorsin yang menangkap cincin epokside melalui ikatannya dengan Hidrogen. Reaksi kimia pertama yang dilakukan adalah dengan melakukan reaksi subsitusi nukleofilik antara cincin epoksida dengan komponnen nukleofilik yaitu
Asp226. Dari reaksi yang pertama ini akan terbentuk ester, yang akan dihidrolisis menjadi dihidrodiol pada reaksi kedua (El-Sherbeni, 2014)
Enzim ini memiliki banyak substrat yang spesifik, yang ketika dihidrolisis menghasilkan hasil akhir senyawa kimia reaktif yang genotoksik. Salah satu hasil metabolit yang banyak diketahui adalah BPDE yang merupakan hasil akhir dari hidrolisa PAH.
Tabel 2.3 Substrat EPHX
Sumber:El-Sherbeni, 2014
Ekspresi dari EPHX1 diatur oleh jumlah faktor transkripsi dan translasinya. Ada beberapa senyawa yang dapat merangsang ekspresi EPHX1 antara lain: 2-asetilaminofluoren, metilkolanthrene, stilbene oxide, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists, phenobarbitone, imidazoles dan logam berat. Sedangkan senyawa yang dapat menghambat ekspresi EPHX1 antara
lain acriflavin, hormon pertumbuhan, gadolinium chlorid, lipopolosakarida and glukokortikoid (El-Sherbeni, 2014)
2.4 EPHX dan Kanker Paru
Telah diketahui bahwa EPHX sebagai enzim yang berperan dalam metabolisme xenobiotik, yang mengkatalisis hidrolisis epoksida dari PAH dan amin aromatik pada asap rokok. Walaupun diketahui bahwa reaksi hidrolisis ini biasanya bertujuan untuk proses detoksifikasi, namun untuk beberapa senyawa seperti BaP dalam asap rokok dihidrolisis menjadi senyawa yang sangat reaktif dan mutagenik. Oleh karena itu aktifitas katalisator EPHX memiliki dua peran yang berbeda yaitu sebagai detoksifikasi dan aktifasi prokarsinogen tergantung dari substratnya (Park, 2005).
Menurut penelitian DeMarini (2004), inhalasi dari PAH dapat meningkat risiko seseorang menderita kanker paru. Diperkirakan ada sekitar 100µg atau lebih PAH per gram tembakau, dan seorang perokok akan terinhalasi PAH ±0,26 µg per pak. Hal ini menyebabkan akan semakin tinggi terbentuk BPDE didalam tubuh yang akan menyebabkan DNA adduct dan protein adduct. Akibatnya akan terjadi mutasi gen terutama pada gen P53 dan Ras protoonkogen akan menyababkan awal terjadinya pembentukan tumor.
Pada daerah koding dari gen EPHX1 terdapat polimorfisme pada ekson 3, dimana basa nukleotida T berubah menjadi C sehingga menyebabkan perubahan asam amino Tyrosin menjadi Histidin pada kodon ke 113. Akibat dari terjadinya perubahan asam amino ini terjadi penurunan aktifitas EPHX 40-50% secara invitro.
Penelitian tentang polimorfisme EPHX1 Tyr113His telah banyak dilakukan diberbagai negara. Pada tahun 2014, Fathy et al melakukan riset pada populasi Turki dan menyatakan bahwa polimorfisme EPHX1 Tyr113His meningkatkan risiko terjadinya kanker paru sebanyak 2,9 kali pada perokok. Hal yang serupa juga ditunjukkan pada penelitian yang dilakukan oleh Erkisi pada tahun 2010 dan Tilak pada tahun 2012, individu dengan genotipe yang membawa alel His113 pada gen EPHX secara signifikan meningkatkan risiko kanker paru.
Adanya interaksi antara lingkungan dengan individu dengan genotype His113His
akan meningkatkan risiko kanker paru sampai 4,52 kali pada perokok. Dari penelitian ini menunjukkan bahwa polimorfisme EPHX pada exon 3 menyebabkan detoksifikasi dari senyawa kimia asap rokok yang karsinogenik menurun sehingga banyak terbentuk senyawa yang mutagenik dan mengawali terjadinya kanker paru
Namun hasil yang berbeda disampaikan oleh Gsur tahun 2003, polimorfisme EPHX1 Tyr113His memberikan efek protektif terhadap kanker paru. Dari hasil penelitiannya didapatkan bahwa polimorfisme pada exon 3 ini menurunkan risiko seseorang menderita kanker paru. Londo pada tahun 2000, dan Wu pada tahun 2001 juga menunjukkan hasil yang serupa. Penelitian ini memberi kesan bahwa polimorfisme EPHX pada exon 3 menurunkan aktifitas EPHX dalam mengaktifkan senyawa BaP sehingga menurunkan risiko terjadi DNA adduct dan Protein Adduct. Hal ini menunjukkan bahwa polimorfisme pada exon 3 memberikan efek proteksi terhadap sel epitel bronkus dari BaP
2.5 Kerangka Konsep
Asap rokok
PAH Senyawa kimia lain
BPDE ↓
Polimorfisme EPHX Tyr113His
DNA Adduct ↓ Protein Adduct ↓ Oksidasi DNA, RNA, protein dan lipid ↓
KANKER PARU ↓ BaP
Mutasi gen P53, KRAs protoonkogen ↓
Merokok
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Jenis Penelitian
Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian analitik perbandingan dengan menggunakan desain Case Control, untuk mengetahui ada atau tidaknya hubungan antara polimorfisme Tyr113His dengan kejadian kanker paru
3.2. Lokasi dan Waktu 3.2.1 Lokasi
Lokasi penelitian adalah Instalasi Rawat Inap dan Rawat jalan RSUP.H.Adam Malik Medan untuk mendapatkan subjek penelitian kelompok kasus dan kelompok kontrol.
Lokasi penelitian untuk melakukan analisa polimorfisme EPHX Tyr113His adalah Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan
3.2.2. Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan selama 7 bulan (bulan Juli 2016 – Februari 2017)
3.3.Populasi Penelitian
Populasi untuk kelompok kasus pada penelitian ini adalah pasien penderita kanker paru yang telah terdiagnosa secara sitologi/histopatologi di Departemen Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi RSUP.H.Adam Malik Medan.
3.4. Kriteria Subjek Penelitian
Subjek penelitian kelompok kasus berasal dari instalasi rawat jalan dan rawat inap Departemen Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi RSUP.H.Adam Malik Medan yang diseleksi berdasarkan kriteria inklusi dan ekslusi.
Subjek penelitian untuk kelompok kontrol berasal dari lingkungan RSUP.H.Adam Malik Medan sesuai dengan kriteria inklusi dan eksklusi.
3.4.1 Kriteria inklusi
a. Kriteria inklusi untuk kelompok kasus:
1. Laki-laki
2. Pasien kanker paru yang terdiagnosis secara sitologi/histopatologi 3. Menandatangani informed consent
b. Kriteria inklusi untuk kelompok kontrol:
1. Laki-laki 2. Merokok
3. Tidak ada gejala klinis pada sistem pernafasan 4. Gambaran foto toraks dalam batas normal
5. Tidak memiliki riwayat kanker paru pada keluarga 6. Menandatangani informed consent
3.4.2 Kriteria Eksklusi
a. Kriteria eksklusi untuk kelompok kasus:
1. Penderita kanker paru yang tidak ada riwayat merokok 2. Penderita kanker paru yang mengalami metastase b. Kriteria eksklusi kelompok kontrol
1. Gambaran foto toraks yang tidak jelas
3.5 Besar Sampel
Penentuan jumlah sampel berdasarkan rumus perhitungan besar sampel minimal untuk masing-masing kelompok seperti pada studi kasus-kontrol, dengan nilai:
P1 = 0,507 (Frekuensi penderita kanker paru dengan genotip Tyr113His (Tilak et al, 2011))
Q1 = 0,493 (1-P1) OR = 4,52 (Tilak et al, 2011) Q2 = 0,815 (1-P2)
P = 0,347 ( ½(P1+P2) Q = 0,653 (1-P) Zα = 1,96 Zβ = 0,84
OR =
;
4,52 = ; P2 = 0,185n1 = n2 =
n1 = n2 = 34,496 dibulatkan menjadi 35 orang, total sampel 2 x 35 = 70 orang.
3.6 Cara pengambilan Sampel
Sampel diambil dengan cara consecutive sampling sesuai kriteria inklusi dan eksklusi
3.7. Variabel Penelitian 3.7.1. Variabel independent:
3.7.1.1 Polimorfisme gen EPHX Tyr113His 3.7.2. Variabel dependent:
3.7.2.1 Kejadian kanker paru
3.8 Definisi Operasional
No Variabel Definisi Cara ukur Hasil Ukur Skala
1 Kanker Paru
Penderita yang telah terdiagnosa secara histopatologi menderita kanker paru di RSUP. H.
Adam Malik Medan
Membaca Rekam Medik
Adenokarsinoma
Skuamous sel karsinoma
Nominal
2 EPHX Tyr113His
Genotif heterozigot varian (TC). asapnya dihirup atau dihisap yang dibedakan berdasarkan bahan baku dan isinya.
Angket Rokok putih
Rokok kretek
Nominal
6 Indeks Brinkman
Tingkatan berat merokok yang diketahui dengan mengalikan jumlah rokok yang dihisap perhari dikalikan dengan lamanya merokok dalam tahun
Angket Ringan 0-200
Sedang 200-600
Berat
> 600
Ordinal
3.9. Kerangka Kerja
3.10. Pelaksanaan Penelitian
3.10.1 Penerbitan Ethical Clearance
Pengambilan sampel darah Penentuan Kategori subjek penelitian
↓ Faktor risiko Kanker Paru
Hubungan polimorfisme EPHX Tyr113His dengan Kanker Paru
Proses isolasi DNA
Wildtype (TT) , heterozigot varian (TC) dan homozigot varian (TT)
Proses amplifikasi DNA
Proses analisa polimorfisme dengan RFLP
Meminta penerbitan ethical clearance kepada komisi etik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
3.10.2 Pengurusan izin penelitian
Meminta izin pelaksanaan penelitian kepada Direktur RSUP.H. Adam Malik.Medan untuk pengambilan sampel dan kepada Kepala Intalasi Laboratorium Terpadu FK USU untuk analisa Polimorfisme gen EPHX Tyr113His.
3.10.3 Proses Seleksi Subjek Penelitian
Subjek penelitian diseleksi berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi di R Adam Malik.
3.11 Proses Pengambilan Sampel
Pengumpulan sampel dari para subjek penelitian untuk kelompok kasus dilakukan di Instalasi rawat jalan/rawat inap Departemen Pulmunologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi RSUP.H.Adam Malik Medan. Pengumpulan sampel dari subjek penelitian untuk kelompok kontrol dilakukan di Instalasi rawat inap Departemen Bedah RSUP.H.Adam Malik Medan. Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil darah sampel dan dimasukkan ke tabung EDTA kemudian disimpan sementara didalam wadah termos es, sebelum dilakukan isolasi DNA di Laboratorium Terpadu FK USU
Alat yang digunakan: Spuit 3 cc, sarung tangan, tabung berisi EDTA, tisu, stiker, spidol, termos es untuk penyimpanan sementara sampel darah
3.11.1 Isolasi DNA Bahan dan Alat : 1. Sarung tangan
2. Pipet automatic 1000µL, 100µL.
3. Tabung Eppendorf 1,5 ml 4. Sentrifus
5. Vortex,
6. Tips steril berbagai ukuran 7. Kertas label
8. Kit ekstraksi DNA [theWizard®Genomic DNA purification Kit]
(Promega Corporation, USA) 9. Stopwatch
10. Kulkas
11. Pena tahan air B. Cara Kerja:
1. Darah EDTA dibolak balik perlahan supaya bercampur dengan EDTA 2. Darah EDTA disentrifus pada 3000 rpm selama 15 menit.
3. Pisahkan plasmanya, lalu ambil 300µL leukosit (Buffy coat) dan masukkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml. Pada saat mengambil buffy coat hendaknya ujung pipet dipotong sedikit, kemudian ditambah 900µL EL Buffer dan campur dengan cara dibolak-balik secara perlahan.
4. Inkubasi selama 10 menit didalam kulkas lalu disentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit.
5. Buang supernatan dengan hati-hati agar endapan tidak ikut terbuang dan tahapan 2 s/d 4 diulangi sampai 3-4 kali dan terlihat warna supernatan menjadi jernih dan endapan berwarna putih.
6. Setelah diperoleh endapan yang berwarna putih atau supernatan yang jernih, buang supernatan dan endapan divortex selama 20 detik.
7. Tambahkan 300µL Nuclei Lysis Solution dan campurkan dengan cara dibolak-balik.
8. Tambahkan 100µL Protein Precipitation, dan vortex selama 20 detik.
9. Campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit.
10. Pindahkan supernatan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml yang berisi 300µL isopropanolol, lalu dibolak-balik sampai terlihat benang-benang DNA.
11. Campuran disentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit, maka akan tampak pellet putih.
12. Buang supernatan dan tambahkan larutan etanol 70%.
13. Sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit.
14. Setelah proses sentrifugasi selesai, etanol diaspirasikan menggunakan pipet dan dikeringkan selama 1 jam.
15. Setelah kering, tambahkan 100 µL DNA Rehidration Solution dan inkubasi pada suhu 4°C selama 1 malam. DNA dapat disimpan di freezer pada suhu -20°C sampai proses PCR-RFLP dilaksanakan.
3.11.2 Amplifikasi isolat DNA dengan Polymerase Chain Reaction Alat dan Bahan
1. Mesin PCR/Thermal Cycler 2. Mikropipet
3. Tabung PCR
4. Tabung Eppendorf 1,5ml 5. Tip steril berbagai ukuran 6. Mesin sentrifugasi
7. PCR mix [Go Taq® Green Master Mix (Promega,USA)]
8. DNA sampel
9. Untuk ekson 3 primer foward 5’-GAT CGA TAA GTT CCG TTT CAC C-3’ dan primer reverse 5’-ATC CTT AGT CTT GAA GTG AGG AT-3’(Macrogen®) Cara Kerja
1. Label tabung PCR sesuai dengan kode nomor sampel.
2. Buat campuran yang terdiri dari 12,5 µL Master Mix ditambahkan 1 µL masing-masing forward dan reverse primer, 8,5 µL nuclease free water, 2µL isolat DNA sampel hingga volume akhir mencapai 25 µL dan masukkan kedalam mesin PCR (Thermal Cycler).
3. Gen EPHX pada DNA sampel diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR (Thermal Cycler) dengan suhu denaturasi inisial 94°C selama 5 menit,
diikuti 35 siklus denaturasi pada 94°C selama 30 detik, annealing pada 55°C selama 30 detik, dan extention pada 72°C selama 7 menit. (Lakhdar et al, 2011) 4. Pada hasil elektroforesis pada agarose 3% akan terlihat fragmen DNA sebesar
163 bp. (Lekhdar, 2011)
3.11.3 Digesti amplifikat DNA dengan Enzim Restriksi Alat dan Bahan
1. Label tabung Eppendorf 1,5ml sesuai kode nomor sampel.
2. Buat campuran reaksi RFLP dengan total volume 10µL untuk setiap sampel ditambahkan 5 U enzim EcoRV.
3. Inkubasi selama 120 menit pada suhu 37°C didalam inkubator.
4. Dilakukan elekroforesis pada agarose 3% maka akan terlihat 1 band pada homozigot Wildtype (TT) dengan ukuran 140 bp, 2 band pada heterozigot varian (TC) dengan ukuran masing 163 bp dan 140 bp , serta 1 band pada homozigot varian dengan ukuran 163 bp (CC) . (Fathy et al, 2014).
3.11.4 Visualisasi Hasil Restriksi dengan Elektroforesa Gel Agarosa Alat dan Bahan
5. Timbangan digital 6. Ethidium Bromide 7. Alumunium foil 8. Gel Casting Tray 9. Gel Comb
10. Gel Documentation 11. DNA Ladder 25-500 bp
Cara Kerja
1. Untuk membuat gel, timbang 1.6 gr agarose dalam 40 ml buffer Tris EDTA 1x.
Panaskan didalam microwave hingga larutan mendidih dan berwarna jernih.
2. Matikan pemanasnya, dan ditambahkan ethidium bromide, dan diaduk kembali.
3. Cairan dituang ke Casting Tray dengan Gel Comb dan biarkan sampai mengeras.
4. Setelah gel mengeras, cabut Gel Comb perlahan-lahan.
5. Pipet 7µL DNA Ladder,produk PCR dan Produk RFLP ke dalam sumur-sumur gel.
6. Catatan posisi sampel pada sumur-sumur gel.
7. Jalankan elektroforesis selama 100 menit dengan tegangan 60 Volt.
8. Pindahkan gel ke dalam Gel Documentation untuk analisa dan dokumentasi hasil elektroforesis.
3.12. Analisa Data 3.12.1 Analisa Univariat
Suatu bentuk analisa data terhadap variabel penelitian yang bertujuan untuk menjelaskan atau mendeskripsikan karakteristik setiap variabel penelitian. Pada analisa ini umumnya hanya menghasilkan distribusi dan persentase dari tiap variabel
3.12.2 Analisa Bivariat
Analisa data bivariat dilakukan pada dua variabel yang diduga berhubungan.
Analisa data bivariat dilakukan pada dua variabel yang diduga berhubungan.