BAB III METODE PENELITIAN
3.7 Pelaksanaan Penelitian
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih jantan sehat galur wistar yang berjumlah ± 50 ekor. Tikus dipelihara di ruang pemeliharaan hewan percobaan Fakultas Farmasi USU Medan. Untuk percobaan, tikus dipindahkan ke ruang eksperimen. Selama pemeliharaan, tikus diberi makanan yang mengandung komponen nutrisi yang cukup dan minum secara ad libitum yang diganti setiap hari.
Penelitian dilakukan untuk mengetahui pengaruh kafein terhadap toksisitas parasetamol dengan cara membandingkan farmakokinetika parasetamol, kadar
AST/ALT dan histopatologi hati, ginjal, dan jantung tikus putih setelah pemberian kafein bersama parasetamol dan setelah pemberian parasetamol tunggal tanpa pemberian kafein, masing-masing dengan 3 variasi dosis parasetamol yaitu 90, 270, dan 900 mg/kg BB, sementara dosis kafein adalah tetap yaitu 27 mg/kg BB.
3.7.2 Pembuatan Bahan-bahan yang digunakan untuk Percobaan 3.7.2.1 Pembuatan Suspensi CMC 0,5%
Sebanyak 0,5 g CMC ditabur dalam lumpang yang berisi 25 ml aquades panas. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan. Sedikit demi sedikit diencerkan dengan aquades sambil digerus, dan dicukupkan hingga volumenya 100 ml.
3.7.2.2Pembuatan Suspensi Parasetamol 10% dalam Larutan CMC 0,5% Parasetamol ditimbang sebanyak 10 g, lalu digerus dalam lumpang. Kemudian ditambahkan larutan CMC 0,5% sedikit demi sedikit sambil digerus, dan dicukupkan volumenya hingga 100 ml.
3.7.2.3Pembuatan Suspensi Kafein 1% dalam Larutan CMC 0,5%
Kafein ditimbang sebanyak 1 g, lalu digerus dalam lumpang. Kemudian ditambahkan larutan CMC 0,5% sedikit demi sedikit sambil digerus, dan dicukupkan volumenya hingga 100 ml.
3.7.2.4Pembuatan Larutan TCA 20%
Sebanyak 20 g TCA ditimbang dan dilarutkan dalam aquades hingga volumenya 100 ml.
3.7.2.5Pembuatan Larutan HCl 6N
Sebanyak 100 ml HCl P diencerkan dengan aquades hingga volumenya 200 ml.
3.7.2.6Pembuatan Larutan NaNO2 10%
Sebanyak 10 g NaNO2 dilarutkan dalam 100 ml aquades. 3.7.2.7Pembuatan Larutan Asam Sulfamat 15%
Sebanyak 15 g asam sulfamat dilarutkan dalam 100 ml aquades. 3.7.2.8Pembuatan Larutan NaOH 10%
Sebanyak 10 g NaOH dilarutkan dalam 100 ml aquades.
3.7.3 Pembuatan Kurva Absorbsi Parasetamol
Parasetamol ditimbang seksama 100 mg dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Kemudian dilarutkan dengan 5 ml etanol 96%, dan diencerkan dengan aquades sampai garis tanda (larutan induk baku/LIB). Dari LIB dipipet 0,3 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah dengan 0,7 ml darah segar tikus, dan 1 ml TCA 20%. Campuran tersebut divortex selama 5 menit kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Setelah itu supernatan sebanyak 0,5 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah dengan 0,5 ml HCl 6 N dan 1 ml NaNO2 10%, biarkan selama 5 menit. Setelah itu ditambahkan dengan 1 ml asam sulfamat 15% dan 2,5 ml NaOH 10%, kemudian diukur pada spektrofotometer visible pada panjang gelombang 400-800 nm.
3.7.4 Penentuan Waktu Absorbsi Tetap (Operating Time) Parasetamol
Pembuatan kurva absorbsi parasetamol dilakukan dengan cara memipet larutan induk baku (LIB) sebanyak 0,3 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah dengan 0,7 ml darah segar tikus, dan 1 ml TCA 20%. Campuran tersebut divortex selama 5 menit kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Setelah itu supernatan sebanyak 0,5 ml diambil dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah dengan 0,5 ml HCl 6 N dan 1 ml NaNO2 10%, biarkan selama 5 menit. Setelah itu ditambahkan dengan 1 ml asam sulfamat 15% dan 2,5 ml NaOH 10%, kemudian diukur pada spektrofotometer
visible pada panjang gelombang yang diperoleh pada kurva absorbsi setiap 1 menit sampai 30 menit.
3.7.5 Pembuatan Kurva Kalibrasi Parasetamol
Pembuatan kurva kalibrasi parasetamol dilakukan dengan cara membuat satu seri larutan parasetamol dengan memipet LIB sebanyak 0,1 ml, 0,2 ml, 0,3 ml, 0,4 ml, dan 0,5 ml, masing-masing ditambah darah segar tikus sampai 1 ml, kemudian ditambah dengan 1 ml TCA 20%. Semua campuran divortex selama 5 menit kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml dan dilakukan prosedur pewarnaan seperti pada pembuatan kurva absorbsi, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang yang diperoleh pada kurva absorbsi.
3.7.6 Pelaksanaan Percobaan
Sebelum percobaan dilaksanakan, tikus ditimbang dan ditempatkan dalam kandang tersendiri di dalam laboratorium. Tikus dipilih secara acak untuk masing-masing kelompok perlakuan. Pelaksanaan percobaan secara skematis dapat ditunjukkan pada Gambar 3.1.
Semua hewan dipuasakan selama 18 jam sebelum percobaan dimulai, tetapi air minum tetap diberikan. Sebelum dilakukan pemberian obat terlebih dulu dilakukan pengambilan darah dan diperiksa kadar AST dan ALT sebagai data awal.
PCT 90 PCT 270 PCT 900 C+PCT 90 C+PCT 270 C+PCT 900 n = 6 n = 6 n = 6 n = 6 n = 6 n =6
Selama 7 hari, 1 x sehari Pada hari ke-7, 4 jam setelah pemberian kafein, diberikan :
dilakukan pengambilan darah pada menit ke : 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, dan 330 Diukur absorbansinya pada spektrofotometer visible
Dilakukan pemeriksaan AST dan ALT Tikus dibunuh dan dibedah
Dilakukan pemeriksaan histopatologis jaringan hati, ginjal, dan jantung tikus
Gambar 3.1 Prosedur Pelaksanaan Penelitian
Kafein 27 mg/kgBB Kafein 27 mg/kgBB Kafein 27 mg/kgBB PCT 90 mg/kgBB PCT 270 mg/kgBB PCT 900 mg/kgBB PCT 90 mg/kgBB PCT 270 mg/kgBB PCT 900 mg/kgBB
Pada kelompok C+PCT 90, C+PCT 270, dan C+PCT 900 pemberian kafein dilakukan per-oral sekali sehari dengan menggunakan oral sonde yang terbuat dari logam selama 7 hari. Pada hari ke-7, empat jam setelah pemberian kafein, kemudian diberikan parasetamol per oral. Kemudian dilakukan pengambilan darah tikus pada menit ke 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, dan 330 setelah pemberian parasetamol masing-masing sebanyak ± 1 ml. Masing-masing cuplikan darah ditambahkan 1 ml TCA 20%, kemudian di vortex selama 5 menit dan selanjutnya disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Semua supernatan diambil sebanyak 0,5 ml dan dilakukan prosedur pewarnaan lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang sesuai kurva absorbsi dengan spektrofotometer visible.
Setelah pengambilan darah selesai, semua tikus dibunuh, darahnya diambil dan kemudian disentrifuge. Serum diambil untuk diperiksa kembali kadar AST dan ALT; dan dilakukan pembedahan, lalu diambil hati, ginjal, dan jantung untuk dibuat preparat histologinya.
Pemeriksaan kadar AST dan ALT dilakukan dengan cara, serum dimasukkan ke dalam cup sample sebanyak 10 μl, kemudian diukur aktivitas enzim dan hasilnya akan tampak dalam waktu 5 menit.
Sebelum dibedah, hewan dibunuh dengan cara dibius dengan dietil eter, selanjutnya dilakukan laparatomi untuk pengambilan hati, ginjal, dan jantung dan diamati secara makroskopik dan mikroskopik. Pengamatan makroskopik dilakukan dengan melihat perubahan warna dan bentuk organ.
Untuk pengamatan mikroskopik organ, dibuat sediaan histologi dengan Metode Parafin, menggunakan pewarnaan HE (Hematoksilin-Eosin) sesuai
dengan cara yang lazim dikerjakan dalam pembuatan preparat. Jaringan hati diambil dari lobus yang sama, demikian juga jantung dan ginjal, kemudian segera difiksasi dalam larutan formalin 10%. Dibuat sediaan dengan metode parafin, lalu jaringan dipotong dengan mikrotom setebal 3-5 μm, kemudian dilakukan pengecatan dengan hematoksilin-eosin (HE), yang akan menyebabkan inti berwarna hitam kebiru-biruan dan sitoplasma berwarna merah. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan histopatologis dengan menggunakan mikroskop cahaya.
Parameter yang dilihat dalam pemeriksaan mikroskopik adalah kerusakan (nekrosis) organ hati, ginjal, dan jantung tikus setelah perlakuan, dibandingkan dengan tanpa pemberian kafein. Alat yang digunakan adalah mikroskop cahaya dengan pembesaran 10x dan 40x. Preparat difoto dengan mikroskop kamera dengan pembesaran 40x.
3.8 Penyajian dan Analisis Data