3 METODE PENELITIAN
3.3 Pelaksanaan Penelitian
Pelaksanaan penelitian ini disajikan pada bagan alir Gambar 2.
Keterangan: - - - adalah objek kajian Gambar 2 Bagan alir penelitian
Produksi total lipid Isolasi dan seleksi
ganggang mikro 28 Isolat Pengambilan sampel
ganggang mikro di Jawa Barat dan Jawa Tengah
Potensi ganggang mikro
Identifikasi ganggang mikro
Bahan Bakar Nabati (BBN) Optimasi pertumbuhan ganggang mikro Analisis pengaruh salinitas dan pH Analisis kadar gula total Kultivasi Ganggang Mikro 4 Isolat Optimasi nitrogen dan fosfor
3.3.1 Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan pada berbagai lokasi dan ekosistem di Jawa Barat dan Jawa Tengah. Lokasi mewakili ekosistem dengan keragaman yang tinggi yaitu ekosistem Kawah Vulkan (Bledug Kuwu), bendungan besar yaitu waduk Sempor, Kebumen Jawa Tengah, kolam dan sawah yang diperkirakan merupakan habitat hidup ganggang mikro. Deskripsi lokasi pengambilan sampel ganggang mikro disajikan pada Lampiran 1.
3.3.2 Tahapan Isolasi dan Seleksi Ganggang Mikro
Tahapan isolasi dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan sampel ganggang mikro yang akan digunakan pada tahapan kultivasi. Tahapan isolasi dilakukan dengan pemurnian biakan pada pengenceran bertingkat. Dari tahapan isolasi kemudian ganggang mikro diseleksi untuk selanjutnya akan dikultivasi pada berbagai volume media biakan.
Tahapan isolasi diawali dengan pemurnian sampel ganggang mikro pada pengenceran bertingkat kemudian seluruh sampel ganggang mikro diisolasi sebanyak 0,25 ml ke dalam erlenmeyer berisi 5 ml volume media M4 dan Mj. Isolat diinkubasi pada 27 ± 20C dibawah cahaya dengan intensitas 1.2 ± 0.5 klux dengan 12:12 jam fotoperiode. Setelah tahapan isolasi dilakukan tahapan seleksi ganggang mikro berdasarkan kecepatan tumbuh, kondisi pertumbuhan, dan keanekaragaman pigmennya. Isolat ganggang mikro yang terseleksi disimpan pada agar miring sebagai stok serta pada gliserol 20%, dan diletakkan didalam freezer.
3.3.3 Tahapan Kultivasi
Tahapan kultivasi dilakukan agar ganggang mikro yang telah terseleksi diperoleh dalam jumlah atau masa sel yang cukup untuk digunakan pada tahapan optimasi. Tahapan kultivasi dilakukan dengan menumbuhkan masing-masing isolat ganggang mikro terseleksi pada erlenmeyer kedalam media dengan volume yaitu 25 ml, 50 ml 150 ml, dan 250 ml. Kultur tunggal dipastikan dengan peremajaan berulang dan pengamatan di bawah mikroskop. Pertumbuhan awal diamati selama selang waktu 7-10 hari setelah ditumbuhkan. Setelah stok kultur pada volume media 250 ml mencapai optical density (OD) 0.2 atau lebih maka biakan ganggang mikro siap untuk digunakan pada tahapan optimasi.
3.3.4 Tahapan Optimasi Pertumbuhan ganggang mikro
Tahapan optimasi pertumbuhan dilakukan dengan menguji pertumbuhan ganggang mikro berdasarkan optimasi nitrogen dan fosfor terhadap produksi total lipid, salinitas dan pH terhadap media biakan dan kadar gula total ganggang mikro dalam larutan media biakan
3.3.4.1 Optimasi Nitrogen dan Fosfor
Optimasi nitrogen dan fosfor dilakukan untuk mengetahui produksi biomasa, dan produksi total lipid ganggang mikro setelah 30 hari masa inkubasi. Sedangkan laju pertumbuhan ganggang mikro diukur selama masa inkubasi. Proses optimasi diawali dengan menumbuhkan kultur biakan ganggang sebanyak 10 ml kedalam media dengan volume 500 ml dengan dua sumber nitrogen dan fosfor pada berbagai konsentrasi. Biakan diinkubasi pada 27 ± 20C dibawah cahaya dengan intensitas 1.2 ± 0.5 klux dengan 12:12 jam fotoperiode. Pada beberapa spesies ganggang mikro, laju pertumbuhan diatur dengan memodifikasikan nitrogen dan fosfor (Lambardi dan Wangersky, 1991). KNO3 dan Urea (CO (NH2)2) merupakan hara yang digunakan sebagai sumber nitrogen. Sebagaimana yang dideskripsikan oleh Change dan Page (1995), laju pertumbuhan ganggang tertinggi dengan NO3-, sedang dengan NH4+ dan yang paling rendah dengan Urea. Sumber fosfor ditambahkan dengan menggunakan KH2PO4 dan TSP (Ca(H2PO4)2). Komposisi sumber nitrogen dan fosfor pada berbagai konsentrasi disajikan pada Lampiran 2. Sumber dan konsentrasi nitrogen dan fosfor disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5 Sumber dan konsentrasi nitrogen dan fosfor Konsentrasi
Sumber
Nitrogen Fosfor
KNO3 dan Urea (CO (NH2)2) KH2PO4 dan TSP (Ca(H2PO4)2)
Standar 20 mM 0.2 mM N1 10 mM 0.2 mM N2 30 mM 0.2 mM N3 40 mM 0.2 mM P1 0.1 mM 20 mM P2 0.5 mM 20 mM P3 1.0 mM 20 mM
3.3.4.2 Produksi Total Lipid
Setelah 30 hari masa inkubasi, biakan ganggang mikro kemudian diukur produksi biomasa dan produksi total lipidnya dengan ketetapan biakan ganggang mikro telah mencapai kerapatan sel (OD) 0.2 atau lebih pada akhir masa inkubasi. OD diukur pada panjang gelombang ( ) 680 nm dengan spektofotometer (Lee et al., 1998).
Pengukuran produksi total lipid dilakukan dengan proses ekstraksi. Proses ekstraksi lipid ganggang mikro dilakukan dengan metode chemical solvent oil extraction (Bligh dan Dyer, 1959), yaitu dengan menggunakan bahan kimia sebagai pelarut. Pelarut kimia yang digunakan adalah metanol dan chloroform dengan tahapan : tabung ditimbang dan dicatat berat tabung reaksi kosong; dimasukkan perlakuan ganggang, disentrifuse 3500 rpm selama 10 menit; dibuang supernatan lalu disimpan dalam oven selama 1 malam hingga kering (800C); biomasa ganggang mikro yang telah kering ditambahkan dengan 4 ml aquadest bebas ion; ditambahkan metanol 10 ml dan chloroform sebanyak 5 ml; dishaker kembali selama 1 malam; kemudian ditambahkan kembali aquadest bebas ion 5ml + 5 ml chloroform; sentrifuse 3500 rpm selama 10 menit; diambil endapan lipid yang mengendap selanjutnya diletakkan di dalam tabung reaksi dan dipanaskan untuk menghilangkan campuran larutan kimia yang ditambahkan sebelumnya.
Perhitungan % total lipid ganggang mikro adalah:
Keterangan: Lw = Berat Lipid (g) Bw = Berat biomasa (g)
3.3.4.3 Analisis Pengaruh Salinitas dan pH
Analisis pengaruh salinitas dan pH dilakukan untuk mengetahui kondisi media biakan yang sesuai terhadap salinitas dan pH bagi pertumbuhan sel ganggang mikro melalui pengukuran rapat optis (OD) yang diukur setelah 30 hari masa inkubasi. Masing-masing perlakuan di ulang 3x. Kombinasi perlakuan faktorial 3 x 3 dari 3 taraf salinitas dan 3 taraf pH disajikan pada Tabel 6.
Lw
% Total lipid = X 100 Bw
Tabel 6 Kombinasi perlakuan faktorial 3 x 3 dari tiga taraf salinitas dan tiga taraf pH Salinitas (mol/L) Nacl pH 5.0 (B1) 7.0 (B2) 9.0 (B3)
0.2 (A1) A1B1 A1B2 A1B3
0.4 (A2) A2B1 A2B2 A2B3
0.6 (A3) A3B1 A3B2 A3B3
Steel dan Torrie (1981), memberikan model matematis untuk rancangan acak lengkap faktorial sebagai berikut:
Y ij = + αi + βj + (αβ) ij + εij dimana: Y ij = Respon
= Nilai Tengah Populasi
αi = Pengaruh dari faktor 1 (salinitas)
βj = Pengaruh dari faktor 2 (pH)
(αβ) ij = Pengaruh interaksi faktor Salinitas dan pH
εij = Pengaruh galat percobaan Instrumen statistik yang digunakan adalah SAS 9.1.
3.3.4.4 Analisis Kadar Gula Total
Ganggang adalah organisme yang dapat berfotosintesis. Gula merupakan senyawa organik kompleks pertama yang dibentuk tumbuhan sebagai hasil fotosintesis (Suradikusumah, 1989). Pengukuran kadar gula total dalam larutan media biakan pada ganggang mikro dilakukan dengan menggunakan Spektronik 20. Metode yang digunakan untuk menetapkan kadar gula total ganggang mikro dalam larutan media biakan adalah metode fenol sulfat (Halme et al., 1993). Prinsip metode ini adalah sampel yang mengandung gula (gula sederhana dan turunannya) bereaksi dengan fenol dan H2SO4 akan menghasilkan warna orange - kekuningan yang stabil.
Tahapan Pembuatan kurva standar
Larutan standar glukosa dibuat dalam satuan Bagian Per Juta (bpj) yaitu: 10 bpj, 20 bpj, 40 bpj, 60 bpj, 80 bpj, 100 bpj. Masing-masing larutan standar glukosa dicampur dengan 0.5 ml fenol 5% dan 2.5 ml H2SO4 5N dalam tabung reaksi, dikocok homogen, didiamkan selama 10 menit. Serapan masing-masing konsentrasi larutan baku glukosa diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang ( ) 490nm. Larutan blanko adalah 0.5 ml aquadest dicampur dengan 0.5 ml fenol 5% dan 2.5 ml H2SO4 5N.
Penetapan kadar gula ganggang mikro
Untuk penetapan kadar gula total dalam larutan media biakan, larutan isolat ganggang mikro harus berupa cairan yang jernih, jika ada endapan maka perlu dilakukan penyaringan untuk menghilangkan endapan. Larutan isolat ganggang mikro tanpa endapan diambil 1 ml, dicampur dengan 0.5 ml fenol 5% dan 2.5 ml H2SO4 5N dalam tabung reaksi, dikocok homogen, dan didamkan 10 menit. Serapan masing-masing kandungan gula pada ganggang mikro diukur dengan spektrofotometer pada 490nm. Berdasarkan pembacaan kurva standar glukosa pada 490 nm, diperoleh formula persamaan garis regresi linier yang merupakan hubungan antara konsentrasi larutan standar dengan absorbans dimana y = absorban dan x = konsentrasi.
3.3.5 Identifikasi Ganggang Mikro
Identifikasi dilakukan untuk mengetahui galur ganggang mikro spesifik yang digunakan selama proses penelitian. Identifikasi ganggang mikro yang utama didasarkan pada karakteristik morfologi umum serta sifat-sifat selular seperti: sifat pigmen fotosintetik; struktur sel dan flagela yang dibentuk oleh sel-sel yang bergerak, serta lipid sebagai bahan cadangan organik yang dihasilkan sel. Proses identifikasi dilakukan dengan mengacu pada Bold dan Wynne (1985).
Untuk mengetahui kandungan lipid sebagai bahan cadangan organik yang dihasilkan sel, proses identifikasi dilakukan dengan menggunakan mikroskop flouresence. Prinsip kerja mikroskop ini adalah intensitas cahaya yang tinggi sehingga sampel yang mengandung lipid yang telah diwarnai akan menghasilkan cahaya yang terpendar.
3.3.5.1 Tahapan identifikasi lipid ganggang mikro
Identifikasi ganggang mikro ditetapkan dengan menggunakan pewarnaan
nile red (NR). Larutan stock untuk NR disiapkan dengan menambahkan 2.5 mg NR ke dalam 100 ml aseton. Sel ganggang mikro diwarnai dengan menempatkan 3 ml biakan di petridisk, kemudian ditambahkan 200 l larutan NR. Proses pewarnaan berlangsung selama 30 menit. Diambil 1 tetes sel ganggang mikro yang telah diwarnai dan diletakkan di atas objek glass kemudian diamati dibawah mikroskop flouresence.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN