Daun yang digunakan adalah daun tanaman kelapa sawit varietas MTG (Moderat Tahan Ganoderma), dipilih daun tombak yang masih muda/lembut berwarna hijau cerah, kemudian disterilisasi menggunakan alkohol dan dilap pakai tissue. Kemudian dimasukkan ke dalam amplop/plastik yang telah diberi label.
Isolasi dan Pemurnian DNA
Secara umum, isolasi DNA meliputi tahapan berikut, yaitu : daun kelapa sawit ditimbang masing-masing 0,1 gr sampai dengan 0,3 gr dan dipotong halus dengan gunting secara melintang. Kemudian daun dimasukkan ke dalam mortar untuk digerus dan ditambahkan nitrogen cair sampai tergenang. Daun digerus sampai halus melawan arah jarum jam. Ke dalam mortar ditambah 0,1 g PVPP sebagai antioksidan, kemudian digerus kembali hingga benar-benar lumat. Hasil gerusan dipindahkan kedalam tabung mikro 2 ml, ditambah 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10μl β-mercaptoethanol, kemudian divortex hingga rata. Masing-masing tabung diberi tanda sesuai dengan sampel yang digunakan. Tabung tersebut diinkubasi ke dalam pemanas air bersuhu 65º C selama 30 menit, setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara regular. Setelah selesai dipanaskan dimasukkan 1 ml larutan KIAA ke dalam tabung. Kemudian tabung dikocok lagi hingga homogen. Tabung disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
Bila ekstraksi berhasil maka supernatant akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Kemudian fase atas dipindahkan ke tabung mikro lain 2 ml dan
ditambah 1 ml larutan KIAA dan kembali disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan yang sama. Supernatant dipindahkan ke tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 1 ml isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan adanya benang-benang halus putih yang muncul. Bila benang-benang halus putih sudah tampak jelas disimpan pada suhu 4ºC selama 30 menit. Setelah 30 menit cairan isopropanol dalam tabung dibuang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan lalu dikeringanginkan. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan 100μl buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi antara pelet dengan buffer TE (Orozco-Castillo, et al., 1994)
Bila masa inkubasi selesai, ke dalam tabung ditambahkan 1 ml etanol 100% dan dikocok kembali secara perlahan dan disimpan pada suhu 4ºC selama 30 menit. Tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya fase atas dibuang, tabung dikeringanginkan kemudian ditambah 100 μl buffer TE dan pelet DNA disuspensikan ke dalam buffer. Stok DNA yang diperoleh disimpan pada suhu ± - 20ºC bila tidak digunakan.
Uji Kuantitas DNA
Sebanyak 2 μl stok DNA diukur menggunakan Spektofotometer sinar UV.
Absorban diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian DNA ditentukan dari nilai perbandingan A260/A280.
Konsentrasi DNA = faktor konversi x faktor pengenceran x A260 Tingkat kemurnian DNA ditetapkan dengan membandingkan nilai absorbansi pada A260 nm terhadap A280 nm. Bila rasio perbandingan menunjukan nilai 1,8-2,0 maka tingkat konsentrasi DNA dinyatakan memenuhi syarat untuk dianalisis selanjutnya.
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan cara memasukkan 5μl stok DNA ditambah 2μl loading dye dan dihomogenkan.
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8 % (b/v).
Agarose ditimbang 0,64 g kemudian dilarutkan kedalam 80 ml buffer TAE 1x.
Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Apabila setelah pemanasan volume dalam tabung berkurang maka ditambah aquades sampai batas tanda dan kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih kemudian didinginkan dan bersamaan dengan itu, ditambah larutan etidium bromide 0,5 %. Kemudian dihomogenkan dengan magnetik stirer, lalu didinginkan dengan cara, tabung dialirkan pada air yang mengalir.
Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60ºC), larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dala m elektroforesis dan diberi larutan TAE (Tris-acetate-EDTA) 1x ± 670 ml (hingga terendam). Stok DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Pada saat stok DNA akan dimasukkan ke dalam sumur gel, maka setiap stok DNA diberi loading buffer (pewarnaan) sebanyak 2μl dan stok DNA 5μl kemudian dicampur dengan mikropipet dan setelah rata masing-masing dimasukkan ke dalam sumur gel.
Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA
yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dan didokumentasikan.
Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.
Amplifikasi
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer yang tersedia.
Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 5 μl stok DNA dan ditambah 50μl ddH2O sehingga diperoleh 50 μl aliquot DNA.
Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius 5 menit setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer yaitu dengan mengambil 10-15 μl stok primer.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu paket PCR Go Taq Green Master Mix produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Untuk mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel yang akan digunakan maka larutan master terdiri atas: ddH20 9,5 μl x 5 = 47,5 μl, Go Tag Green Master Mix 12,5 μl x 5 = 6,25 μl, aliquot primer 1 μl x 5 = 5 μl.
Dari tube diambil 23 μl ke tube yang lain sehingga diperoleh 20 tube untuk PCR dan ditambahkan masing-masing DNA sebanyak 2 μl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran masker dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR dengan annealing 36º C. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied Biosystem didesain waktu, suhu dan jumlah siklus termal 45 kali yang telah digunakan pada tanaman kelapa sawit, berdasarkan yang digunakan pada penelitian Setyo (2001). Proses amplifikasi PCR dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Siklus, suhu dan waktu dalam amplifikasi
Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 1,5 % (b/v). Agarose ditimbang 1,04 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 80 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening. Setelah larutan dipanaskan kemudian didinginkan ditambah larutan etidium bromide 1µ. Kemudian dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan cara yang sama. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60ºC) larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming combs) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras. Well-forming combs dilepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk
elektroforesis.
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam tank elektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ± 670 ml (hingga terendam) hingga 1 mm di atas permukaan gel atau sampai batas yang telah ditentukan. Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur (well), tank elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses elektroforesis siap dijalankan. Elektroforesis dilakukan pada kondisi 65 volt
selama 60 menit. Setelah elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan tary diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel pada UV transluminator dan jika pita/band molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.
Analisis Data
Penentuan Skoring Marka RAPD
Pola pita yang muncul pada gel diterjemahkan ke dalam data biner dengan scoring manual. Setiap pita mewakili satu karakter dan diberi nilai berdasarkan ada tidaknya pita. Angka satu “1” untuk pita yang terbentuk (ada) dan angka nol
“0” untuk pita yang tidak terbentuk (tidak ada).
Untuk melihat persentase pita polimorfik menggunakan rumus berikut ini:
% Pita Polimorfik = x 100%
Penetuan Ukuran Pasangan Basa
Ukuran fragmen basa (pasangan basa= bp) produk PCR ditentukan dengan menggunakan software UVITEC Cambridge FireReader. Fragmen DNA yang digunakan yaitu sebesar 100 bp DNA leader. Dengan menggunakan software UVITEC Cambridge FireReader maka ukuran pita DNA (base pairs) ini akan berpacuan dari ladder yang kita gunakan. Program ini akan mengukur pita yang muncul berdasarkan ukuran ladder yang digunakan. Pengukuran pola pita yang terbentuk ini dengan pendar cahaya DNA yang terbentuk saat proses elektoforesis dengan sinar UV.
Σ lokus yang polimorfik Σ lokus semuanya
Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari keragaman : (1) Principal Coordinates Analyisis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan (2) Neighbor-Joining Tree (NJtree). Perhitungan dan analisis deskriptif ini menggunakan software DARwin 6.0.15.