Semua alat disiapkan seperti pisau dan plastik sampel, lalu diambil sampel daun muda di lapangan. Daun dibersihkan dengan air mengalir kemudian di keringkan dengan tisu kemudian dibuang tulang daunnya dan dibawah ke laboratorium Fakultas Pertanian.
Isolasi DNA
Ekstrak DNA dari daun kelapa sawit dilakukan menurut metode CTAB Orozco-Castilo et al. (1994) yang dimodifikasi khususnya penambahan Polyvinyl-Polypyrolidone (PVPP) dan β-merkaptoethanol (Toruan-Mathius et al. 1997 ;
Asmono et al. 2000). Sebanyak 0,3 gr daun muda kelapa sawit yang sudah dicuci dan bersih, di potong dengan gunting lalu di masukan ke dalam mortar dengan penambahan nitrogen cair kemudian ditambahkan ± 0,1 gr- 0,3 gr Polyvinyl-Polypyrolidone (PVPP) digerus hingga halus. Serbuk halus yang dihasilkan
kemudian dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml yang berisi 1 ml buffer CTAB yang telah dipanaskan dan diberi 10 μl β-merkaptoethanol. Campuran tersebut kemudian dikocok selama 5 menit dan dipanaskan selama 30 menit pada suhu 65oC di waterbath (Setiap 10 menit sekali larutan di bolak balik dengan perlahan agar homogen). Larutan dibiarkan dingin pada suhu kamar lalu, ditambahkan khloroform : isoamil alkohol (24:1) (KIAA) sebanyak 1 ml ke dalam tabung.
Tabung tersebut disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Supernatan yang diperoleh diambil dan dipindahkan ke dalam tube yang baru. Kemudian ditambahkan 1ml khloroform: Isoamil alkohol, Tube tersebut dikocok bolak balik, kemudian tube tersebut disentrifuge selama 10 menit dengan
19
kecepatan 13.000 rpm, supernatan yang diperoleh di pindahkan kembali ke tube yang lain dan di tambahkan isopropanol dingin sebanyak 1 ml lalu di kocok tabung perlahan hingga terbentuk benang-benang halus berwarna putih kemudian simpan dalam lemari es selama satu malam.
Tabung di keluarkan dari lemari es, Kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Cairain isopropanol di buang dan benang-benang halus dalam tabung ditinggalkan kemudian dikering anginkan. Lalu ditambahkan dengan buffer TE (Tris EDTA) 100 µL dan dispin manual agar terbentuk pellet dengan buffer TE. Tabung dibolak balik kemudian ditambahkan 1 ml etanol absolute dan dikocok kembali secara perlahan kemudian cairan atas dibuang dan pellet dikeringanginkan kembali setelah dikeringanginkan ditambah dengan buffer TE 100 µL. Stok DNA yang diperoleh disimpan pada suhu ± 20oC bila tidak digunakan.
Uji Kuantitas DNA
Pengujian di lakukan dengan menggunakan Spektofotometer UV-vis. Di ambil stok DNA dari lemari es, kemudian di kocok dengan vortex. Sebanyak 2 μl stok DNA di ambil dan diteteskan ke spektofotometri dan dapat diperoleh kemurnian dan konsentrasi DNA sampel. Tingkat kemurnian DNA di tentukan dengan nilai perbandingan A 260/A 280. Menurut Wilson dan Walker (2010), sampel DNA murni akan menghasilkan rasio A 260/A280 berkisar 1,8-2,0. Nilai kemurnian yang lebih dari 2,0 menunjukan sampel mengandung kontaminan RNA, sedangkan nilai kemurnian yang kurang dari 18 menunjukan bahwa sampel mengandung kontaminan protein (Yuwono, 2006).
20
Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan cara memasukkan 3 μl stok DNA ditambah 1 μl loading dye kedalam sumur gel agarose 0,8 % yang telah dilakukan sebelumnya oleh Harahap (2013).
Sebelum dilakukan elektroforesis, Agarose ditimbang 1,6 gr kemudian dilarutkan kedalam 80 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening hingga 35 menit lalu didinginkan ditambahkan 1 μL etidium bromida, diaduk dan didinginkan hingga (suhu ± 60oC).
Kemudian di masukan ke dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan kedalam elektroforesis dan diberi larutan TAE 1x 300 ml (hingga terendam). Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan kedalam sumur gel. Pada saat stok DNA di beri Loading dye (pewarnaan) sebanyak 1 μL dan stok DNA sebanyak 3 μL kemudian di campur dengan mikropipet setelah merata masing-masing di masukan ke dalam sumur gel dan selanjutnya dielektroforesis. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 70 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dan didokumentasikan.
Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.
21
Amplifikasi PCR- pemilihan marka SSR
Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan primer SSR, Sesuai prosedur Billotte et al. (2005) di tampilkan pada (Tabel 1.) Amplifikasi dilakukan sebanyak 5 primer SSR. Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 9 µl stok DNA dan ditambah 15 µl ddH20 sehingga diperoleh 24 µl aliquot DNA.
Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Untuk mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel yang akan digunakan maka larutan master terdiri atas: ddH20 3,5 µl x 5 = 17,5 µl, Go Tag 7,5 µl x 5 = 37,5 µl, (primer R 1 µl x 5 = 5 µl dan primer F 1 µl x 5 = 5 µ) . Dari tube diambil 13 µl ke tube yang lain sehingga diperoleh 5 tube untuk PCR dan ditambahkan masing-masing DNA sebanyak 2 µl. Kemudian tabung dispin manual lalu dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR dengan annealing 52o C. Reaksi amplifikasi Gene Amp PCR Applied Biosystem didesain waktu, suhu dan jumlah siklus termal 30 kali yang telah digunakan pada tanaman kelapa sawit, tertera pada Tabel 2. (Putri, 2010).
Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu 20 OC bila sedang tidak digunakan.
22
Tabel 1. Primer SSR yang digunakan dalam penelitian
(Billotte et al. 2005)
Gel agarose disiapkan dengan konsentrasi 4%, dengan agarose sebanyak 3,2 gr yang dilarutkan dalam buffer TBE 1X sebanyak 80 ml di masukan kedalam Erlenmeyer seperti yang dilakukan Nasution, et al. (2011), serta di panaskan dan di beri pengaduk magnetic sampai larutan menjadi bening. Setelah larutan di panaskan lalu didinginkan untuk sementara hingga suhu 60o C dan ditambahkan sebanyak 0,5 µL Etidium bromide dan dipanaskan kembali dengan cara yang sama. Setelah larutan mendingin dengan suhu 60o C larutan dicetak dan dimasukkan ke dalam cetakan agar yang telah di pasang sisir pembuat lubang (well-forming combs), setelah memadat dan gel mengeras well-forming combs, di lepas secara perlahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.
No. Nama
Primer Forward sequence Reverse sequence
1 FR SSR-1 ACGTTTTGGCAACTCTC ACTCCCCTCTTTGACAT
2 FR 3745 GGAAGTCTTGATGTTGAAAG ATCAAGCAGTCGCATAATAC
3 FR 0783 GAATGTGGCTGTAAATGCTGAGTG AAGCCGCATGGACAACTCTAGTAA 4 FR 0779 ATGCAGACCAAGCTAATCATATAC GTTCAGGTGATGGTGACTCAGATAG
23
Untuk elektroforesis tray yang berisi gel agarose diletakkan ke dalam bak elektroforesis dan di tambahkan larutan buffer TBE 1x dituang ke dalam bak tersebut ± 300 ml (hingga terendam) atau sampai batas yang telah ditentukan.
Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur pada gel. Setelah semua sampel dimasukkan dalam sumur (well), serta Ladder 100 bp sebanyak 3 yang di tambahkan Loading dye sebanyak 1 µl selanjutnya bak elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Kemudian proses elektroforesis siap dijalankan. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 50 volt selama 240 menit. Setelah running elektroforesis selesai, arus listrik dimatikan dan gel diambil dengan menggunakan sarung tangan. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator dengan cara meletakkan gel pada UV transluminator dan jika pita/band molekul DNA kelihatan terang maka didokumentasikan.
24