Tahap awal dari penelitian ini dimulai dengan pentapan areal penelitian. Kegiatan ini memilih dan menandai tanaman yang dijadikan tanaman sampel dengan metabolism tinggi (quick starter) yaitu PB260 berada di afdelling 1 dan metabolisme rendah (slow starter) yaitu RRIM 921 di afdelling 2. Umur tanaman yang digunakan adalah tahun 2006 dan tahun 2007, dan penyadapannya di Bidang Panel 2. Tanaman sampel ditandai dengan jelas, dengan menggunakan cat minyak dan spidol pada setiap sampel tanaman. Sampel tanaman merupakan tanaman yang mengalami kejadian Kering Alur Sadap sebagian (KAS Parsial).
Pengukuran Lilit Batang dan Panjang Panel
Pengukuran ini dilakukan setelah plotting areal penelitian. Pengukuran ini dilakukan untuk mengetahui keseragaman dari setiap tanaman sampel yang ditandai. Pengukuran lilit batang dimulai dari jarak 15cm dari panel sadapan dan pengukuran panjang panel dimulai dari bidang sadapan panel sampai akhir panel atau penampungan lateks. Data yang diperoleh dianalisis koefisien varians keanekaragamannya.
Pengacakan Perlakuan
Perlakuan diacak menggunakan metode pencabutan nomor sesuai dengan banyak perlakuan yang dibutuhkan. Adapun jumlah kombinasi perlakuannya adalah 24.
Pengambilan Data Awal Indeks Produksi (IP)
Diambil data awal lateks untuk dianalisis dengan pengambilan pada saat tanaman disadap pada pagi hari sekitar pukul 06.00 wib dengan mengamati
19
banyak lateks deres pada lima menit pertama dan total lateks yang diperoleh. IP dihtung dengan rumus : IP = ������� 5 �����
����������� x 100%
Pembuatan Zat Pengatur Tumbuh
Dibuatlarutan NAA danAsam Askorbit sesuai dengan kombinasi perlakuan. Ditambahkan gliserin sebanyak 30 ml dan larutan NAA (100 ppm) dan asam askorbit (150 ppm) untuk diaplikasikan dilapangan pada setiap dua minggu pertama sampai bulan ketiga.
Perlakuan Pemberian Zat Pengatur Tumbuh
Larutan diberikan pada setiap tanamannya sesuai dengan kombinasi perlakuan pada masing – masing tanaman berdasarkan panjang panel ataupun bidang sadap. Agar memperoleh perlakuan yang sama pada setiap tanamannya diberikan larutan sesuai dengan kombinasi perlakuan sebanyak 0,6 ml/cm. Perlakuan diberikan dengan cara dioleskan dengan kuas/sikat pada bidang sadap. Interval pemberian perlakuan adalah dua minggu sekali sampai bulan ke – 3. Pengambilan Sampel dan Analisis
Diambil sampel lateks pada saat tanaman setelah dilakukan penyadapan pada pagi hari selama dua minggu sekali sampai bulan ke- 3 dan dibawa dan dianalisis (Fisiologi : Thiol, Fosfat Anorganik, Sukrosa, dan Enzim Superokside Dismutase) dilaboratorium.
Peubah Amatan
Aktifitas Superoksida Dismutase
Analisa senyawa aktifitas SOD dilakukan di Balai Penelitian Karet Sungei Putih. SOD yang diamati berasal dari lateks tanaman karet pada bidang sadapan.
20
1977) yang dimodifikasi. Lateks segar disentrifius selama 15 menit pada suhu 4o C dan temperature 10.000 rpm, lateks yang telah disentrifius dipisahkan dari gumpalan lateks dan diambil fraksi bagian bawah yang bewarna bening lalu dicampurkan dengan buffer ekstrak (50 mM Buffer Potassium dan 1 mM EDTA) (Lampiran.47) sebanyak (100 µl/1,5 ml) untuk mendapatkan hasil yang homogen, kemudian disentrifius kembali dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit. Pereaksi dibuat dengan mencampurkan 50 mM Buffer Pottasium Phosphate sebanyak 750 µl, 13mM L-Methionin sebanyak 50 µl, 75 uM NBT sebanyak 50 µl, 0,1 mM EDTA sebanyak 150 µl, ekstrak lateks sebanyak 100 µl, 2 uM riboflavin sebanyak 50 µl,dan aquadest sebanyak 350 µl dengan total volume 1,5 mL. Riboflavin ditambahkan pada masing-masing tabung dan diinkubasi dibawah cahaya 15 watt selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan mematikan lampu dan menempatkan tabung di tempat yang gelap kemudian dibaca dengan spektrophotometer dengan absorbansi 560 nm. Kadar protein ditentukan sesuai dengan metode Bradford (1976) dengan BSA sebagai standar. Sementara satu unit ekstrak enzim aktivitas SOD didefenisikan sebagai aktivitas SOD (unit/mg protein).
Analisis Thiol (R – SH)
Pengamatan dilakukan pada sampel lateks yang diambil 1 ml langsung dari lapangan kemudian dicampurkankan 9 ml larutan trikloro–asetat (TCA 2,5%) (2,5 g TCA dilarutkan dalam 100 ml akuades) pada masing-masing botol ukur. Lateks diaduk berulang–ulang hingga serum pada lateks tercampur dengan larutan TCA, kemudian campuran larutan TCA dengan serum lateks dipipet sebanyak 1,5 ml dengan menggunakan mikropipet dimasukkan pada tabung reaksi dan
21
ditambahkan pereaksi 75 µ L dithiobis – nitrobenzoat (DTNB) 10 mM (79,3 g DTNB + 148,8 g EDTA + 5 ml buffer tris 0,5 M (30,3 g tris dilarutkan dalam 500 ml aquades) + 5 ml aquades), dan ditambahkan 1,5 ml buffer tris 0,5 M dan divortex membentuk nitrobenzoat (TNB) yang terjadi perubahan warna kuning yang terabsorbsi pada λ 421 nm (nanometer) dibaca dengan spektrofotometer Beckman DU 650 (Bobiliof, 1923). Pengamatan dilakukan pada saat sebelum aplikasi sampai pada pengamatan ke–3 setelah aplikasi.
Analisis Sukrosa
Pengamatan kadar sukrosa menggunakan metode anthrone (Dische, 1962). Pengamatan dilakukan pada sampel lateks yang diambil 1 ml langsung dari lapangan kemudian dimasukkan pada larutan trikloro–asetat (TCA 2,5%) (2,5 g TCA dilarutkan dalam 100 ml akuades) sebanyak 9 ml pada botol ukur. Lateks yang menggumpal akibat diaduk berulang – ulang hingga serum pada lateks tercampur dengan larutan TCA, kemudian campuran larutan TCA dengan serum lateks dipipet sebanyak 150 µL dengan menggunakan mikropipet setelah itu ditambahkan dengan larutan TCA 2,5% sebanyak 350 µL didalam tabung reaksi kemudian ditambahkan kembali pada pereaksi 3 ml anthrone ((0,1 g anthrone + 100 ml larutan asam sulfat pekat (H2SO4 70%)) dan divortex kemudian diinkubasi direndam didalam air mendidih selama 15 menit sehingga akan memberikan turunan furfural dan bereaksi menjadi larutan berwarna biru perubahan warna selanjutnya diamati absorbannya pada λ 627 nm (nanometer) dengan spektrofotometer Beckman DU 650. Pengamatan dilakukan pada saat 1 bulan setelah aplikasi perlakuan sampai pada bulan pengamatan ke -3 setelah aplikasi .
22
Analisis Fosfat anorganik (Pi)
Pengamatan kadar fosfat anorganik berdasarkan prinsip pengikatan oleh ammonium molibdad (Taussky and Shorr, 1953). Pengamatan dilakukan pada sampel lateks yang diambil 1 ml langsung dari lapangan kemudian dimasukkan pada larutan 9 ml trikloro – asetat (TCA 2,5%) pada botol ukur. Lateks yang menggumpal akibat diaduk dengan batang gelas berulang–ulang hingga serum pada lateks tercampur dengan larutanTCA. Campuran larutan TCA dengan serum lateks dipipet sebanyak 0,3 ml dipipet dengan mikropipet dan ditambahkan dengan 1,2 ml larutan TCA 2,5% di dalam tabung reaksi. Larutan tersebut kemudian dicampurkan dengan 1 ml pereaksi ((5 g FeSO4 + 50 ml aquades + 10 ml larutan stock molibdat (27,8 ml H2SO4 70% + 10 g amonium heptamolibdat + 70 ml aquades) dan diterakan dengan menggunakan aquades hingga 100 ml)) campuran tersebut divortex dan didiamkan pada suhu kamar (25ºC) selama 10 menit sehingga tereduksi dalam reaksi asam yang menyebabkan perubahan warna pada larutan tersebut menjadi warna biru, perubahan warna yang kemudian diamati absorbannya pada λ 627 nm (nanometer) dengan spektrofotometer Beckman DU 650. Pengamatan dilakukan pada saat 1 bulan setelah aplikasi perlakuan sampai pada pengamatan ke -3 setelah aplikasi .
Produtivitas Lateks (g/p/s)
Pengamatan terhadap produktivitas pada lateks tanaman karet dilakukan setiap 3 hari sekali setelah aplikasi perlakuan sampai pengamatan ke – 3. Produksi di tiap-tiap pohon dirtimbang kadar berat keringnya, dengan rumus :
g/p/s = produksi (g)
23