Pegagan yang dipergunakan sebanyak 3 kg karena untuk setiap bahan alami berat kering yang didapat ialah 10%-12% dari berat sebelum dikeringkan. Yang berarti berat kering yang didapat dari 3 kg pegagan ialah 300-400 gram yang sesuai dengan kapasitas satu buah perkolator dan diperkirakan akan dapat menghasilkan ekstrak etanol pegagan yang cukup untuk melakukan pengujian antibakteri. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini ialah pelarut etanol karena relatif aman, bersifat tidak toksik dan bisa digunakan untuk melarutkan berbagai senyawa organik yang tidak dapat larut dalam air.34
Pengujian efek antibakteri dapat dilakukan dengan metode tes konvensional yaitu disk diffusion dan broth dilution (dilusi). Metode difusi menggunakan paper disk yang diberi antibiotik yang diletakkan di atas permukaan agar media yang telah ditanam bakteri sehingga terbentuk zona hambat disekitar disk lalu diukur diameter zona hambatnya. Penelitian dengan metode dilusi dilakukan serangkaian pengenceran berganda sehingga didapat konsentrasi bahan coba yang besarnya setengah dari konsentrasi awal.35
Dalam penelitian ini menggunakan metode dilusi yang dikombinasikan dengan metode Drop Plate Miles Misra. Dengan metode ini bahan coba berkontak langsung dengan mikroorganisme sehingga hasil yang diperoleh lebih akurat dan dapat diketahui nilai KHM dan KBM dari bahan coba.9 Penelitian dilakukan dengan metode dilusi dengan cara pengenceran ganda sehingga didapat konsentrasi bahan coba yang
besarnya setengah dari konsentrasi awal yaitu 100 %, 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25% dan 3,125%. Masing-masing konsentrasi bahan coba direplikasi sebanyak 4 kali agar diperoleh hasil yang lebih akurat.
KHM dilihat dari konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam dan tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri secara makroskopik yang dapat dilihat dari hasil biakan pada tabung yang mulai berubah menjadi jernih dengan menggunakan metode dilusi. Hasil penelitian menunjukkan dari semua konsentrasi bahan coba yang telah diuji, tidak terdapat larutan yang dapat berubah menjadi jernih. Penyebabnya diduga karena ekstrak etanol pegagan tersebut dari awal berwarna hijau kehitaman sehingga ketika disuspensikan dengan bakteri akan berwarna hijau keruh yang menyebabkan kesulitan untuk menentukan pada konsentrasi berapa berubah menjadi jernih.
Selain itu ekstrak etanol pegagan juga mengandung zat aktif yang bersifat nonpolar sedangkan MHB menggunakan pelarut yang bersifat polar. Hal ini kemungkinan menyebabkan terjadinya pemisahan zat aktif yang bersifat non polar dari MHB sehingga menyebabkan kekeruhan yang terjadi. Oleh karena itu, sulit membedakan perubahan kekeruhan yang terjadi pada setiap konsentrasi dan dianggap tidak representatif untuk mencari KHM. 35,36
Penentuan KBM dilihat dari konsentrasi minimal bahan uji pada biakan padat (MHA) dimana tidak terlihat pertumbuhan bakteri atau seluruh bakteri mati pada media perbenihan. Dari hasil penelitian terlihat setelah bakteri disuspensikan dan diinkubasikan selama 24 jam, pada konsentrasi 100% tidak terlihat adanya pertumbuhan bakteri (steril), begitu juga pada konsentrasi 50%, dan 25%. Pada
konsentrasi 12,5% terlihat adanya pertumbuhan bakteri yang subur pada media sehingga jumlahnya TBUD.
Penelitian dilanjutkan dengan memperkecil konsentrasi karena pada penelitian yang telah dilakukan didapatkan nilai KBM berkisar antara 12,5%-25%. Konsentrasi yang digunakan dimulai dari 15%, 17,5%, 20% dan 22,5% dengan tujuan untuk mengetahui nilai KBM secara terperinci. Setelah bakteri disuspensikan dan diinkubasi selama 24 jam, konsentrasi 15%, 17,5% dan 20% memiliki jumlah bakteri yang TBUD. Konsentrasi 22,5% memiliki jumlah koloni bakteri dengan rata-rata 3,24 x 1015 CFU/ml . Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa nilai KBM ekstrak etanol pegagan terhadap Porphyromonas gingivalis adalah 25%.
Pada penelitian ini walaupun nilai KHM tidak diketahui, tetapi hasil penelitian menunjukkan bahwa bahan coba ekstrak etanol pegagan memiliki efek antibakteri terhadap Porphyromonas gingivalis dengan nilai KBM 25%. Dengan demikian hipotesis penelitian diterima walaupun data yang didapat tidak bisa dilakukan uji statistik dengan uji ANOVA dan LSD disebabkan hasil yang diperoleh adalah 0 dan TBUD (Tidak Bisa Untuk Dihitung).
Penelitian ini membukt ikan bahwa ekstrak etanol pegagan memiliki efek antibakteri secara in-vitro. Infeksi saluran akar merupakan infeksi yang polimikrobial sehingga kemungkinan akan memberikan efek antibakteri yang berbeda bila ekstrak etanol pegagan diletakkan dalam saluran akar.
Terdapat perbedaan hasil penelitian efek antibakteri ekstrak etanol pegagan terhadap beberapa bakteri. Jagtap et al (2009) menemukan KHM pada beberapa bakteri, diantaranya Propionibacterium vulgaris, Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Aspergillus niger dan Candida albicans dengan nilai KHM 125 µg/ml. Sedangkan pada Bacillus subtilis dan Aspergillus flavus adalah 62,5 µg/ml.12 Perbedaan ini dapat disebabkan oleh beberapa hal diantaranya metode, asal tanaman, bakteri, dan bahan yang digunakan. Peneliti menggunakan metode dilusi sedangkan Jagtap et al menggunakan metode agar diffusion test.
Asal tanaman pegagan yang berbeda kemungkinan akan memberikan hasil uji yang berbeda pula. Keadaan geografis dari masing-masing daerah yang berbeda-beda kemungkinan menyebabkan kadar senyawa aktif yang terkandung dalam kedua tanaman tidak sama antara satu dengan yang lain. Pegagan yang digunakan peneliti berasal dari Desa Durian, Kec. Pantai Labu Deli Serdang, sedangkan tanaman pegagan pada penelitian Jagtap berasal dari Amravati, India.
Morfologi bakteri merupakan salah satu penyebab terdapatnya perbedaan hasil penelitian. Morfologi bakteri yang berbeda menyebabkan struktur dinding sel bakteri juga berbeda sehingga diduga menyebabkan perbedaan aktivitas dan besar konsentrasi bahan coba dalam membunuh sel bakteri tersebut. Bakteri yang diuji peneliti ialah Porphyromonas gingivalis.
Porphyromonas gingivalis merupakan bakteri berpigmen hitam gram negatif obligat anaerob. Bakteri gram negatif memiliki lapisan-lapisan dinding sel yang lebih kompleks dibandingkan bakteri gram positif baik secara struktur maupun kimianya sehingga senyawa antibakteri pegagan lebih sulit berdifusi ke dalam membran sel (Gambar 19). Secara struktur, dinding bakteri gram negatif mengandung dua lapisan eksternal pada membran sitoplasma. Pada bagian luar sampai membran sitoplasmanya terdapat lapisan peptidoglikan yang tipis. Area diantara permukaan eksternal dari
membran sitoplasma dan permukaan internal dari membran luar diisi oleh ruangan periplasma.37 Dinding sel gram negatif mengandung tiga komponen yang terletak pada lapisan luar yaitu peptidoglikan, lipoprotein, membran luar dan lipopolisakarida.38 Porphyromonas gingivalis juga merupakan bakteri yang memiliki kapsul pada eksternal dan membran luarnya.8
Gambar 19. Perbandingan dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif. A) Bakteri gram positif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal yang mengandung techoic acid dan LTA, B) Bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis dan membran luarnya mengandung LPS, fosfolipid dan protein. Ruang periplasmik antara membran sitoplasma dan membran luar mengndung transport, degradasi dan sintesis protein dinding sel. Membran luar bergabung dengan membran sitoplasma di titik perlekatan dan diikat peptidoglikan melalui jembatan lipoprotein.36
Efek antibakteri yang ditimbulkan oleh ekstrak etanol pegagan terhadap Porphyromonas gingivalis kemungkinan disebabkan oleh senyawa aktif yang
dikandungnya. Ekstrak etanol pegagan memiliki kandungan berupa saponin, alkaloid, flavonoid dan tanin yang memiliki efek antibakteri. Kematian bakteri Porphyromonas gingivalis mungkin disebabkan oleh saponin yang bekerja sebagai sabun/deterjen yang membuat senyawa ini terkonsentrasi pada permukaan sel. Ujung hidrofobik deterjen akan berikatan dengan ujung hidrofobik protein dengan menggeser sebagian besar ujung lipid yang terikat. Ujung polar deterjen merupakan suatu ujung yang bebas, sehingga membawa protein ke dalam kompleks deterjen-protein, yang biasanya mengandung beberapa unsur lipid residual. Sifat ini menyebabkan senyawa ini mampu melarutkan protein membran.34,38
Flavonoid bekerja dengan memiliki target sel yang multipel, tidak pada target yang spesifik. Tanin juga bekerja dengan cara melakukan interaksi non spesifik pada protein vital seperti enzim bakteri. Dengan cara ini flavonoid dan tanin merusak sel bakteri.31,32 Alkaloid bersifat toksik sehingga dapat melawan sel yang berasal dari organisme asing. Mekanisme kerja antimikroba dari alkaloid dapat berikatan dengan DNA sel sehingga mengganggu fungsi sel diikuti kematian sel.30 Uji coba efek antibakteri terhadap Porphyromonas gingivalis menggunakan ekstrak etanol pegagan secara keseluruhan tanpa memisah-misahkan senyawa yang terkandung di dalamnya sehingga tidak diketahui zat aktif mana yang paling berperan dalam memberikan efek antibakteri.