BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Pembahasan
Penetapan kadar medroksiprogesteron asetat (MPA) dalam plasma in
vitro dilakukan sebagai pengujian terhadap sediaan farmasi dari segi farmakokinetiknya, bagaimana ketersediaan hayati obat dalam tubuh sehingga keefektivitasannya terbukti. Optimasi dan validasi juga perlu dilakukan guna mendapatkan metode yang terbaik untuk analisa kadar medroksiprogesteron asetat dalam plasma. Penetapan kadar ini dilakukan dengan instrumen kromatografi cair kinerja tinggi dengan mempertimbangkan senyawa aktif yang dianalisa larut dalam fase cair, serta alat ini memiliki ketelitian yang tinggi dan spesifik.
Hal yang pertama kali dilakukan adalah penentuan panjang gelombang
maksimum dengan menggunakan spektrofotometer ultraviolet – visibel, dan
didapatkan hasil bahwa MPA memiliki serapan maksimum pada 241 nm. Pemilihan panjang gelombang analisis ini berguna untuk meningkatkan selektivitas dan sensitifitas analisis dari sampel yang digunakan.
Pada pemilihan fase gerak, dilakukan dengan menggunakan kolom C18 Eurospher® fase terbalik dengan panjang gelombang analisa 241 nm dan
kecepatan alir 1,2 mL/menit. Komposisi dari asetonitril – air yang diasamkan
dengan asam fosfat pada pH = 4 (60:40 v/v) menghasilkan luas area rata-rata sebesar 604008 untuk konsentrasi 10 µg/mL, plat teoritis sekitar 2752,59, HETP sekitar 0,0055, faktor kapasitas sebesar 5,54, asimetri sekitar 1,5 dengan waktu retensi sekitar 9,3 menit. Dari hasil ini, fase gerak yang ditetapkan telah memberikan hasil parameter yang memenuhi persyaratan.
Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan kesesuaian dan keefektifan sistem yang digunakan agar diperoleh kondisi operasional dan kromatogram yang baik. Dari hasil percobaan diperoleh nilai rata-rata, yaitu jumlah plat teoritis 2752,59 (>2500), faktor kapasitas 5,54 (2-8), asimetris 1,5 (<2,5), dan koefisien variasi 0,554% (<2%). Hasil ini telah memenuhi persyaratan uji, yang menunjukan bahwa sistem alat yang digunakan telah memenuhi kesesuaian dan keefektifan sistem operasional.
Pada penetapan metode ekstraksi, dilakukan penarikan MPA dengan mengendapkan protein plasma. Pengendapan protein ini bertujuan untuk menghilangkan komponen-komponen yang ada dalam protein plasma yang dapat mengganggu analisis dan kromatogram. Protein plasma dapat diendapkan dengan berbagai pelarut; seperti pelarut organik, pelarut asam, dan pelarut basa. Pada penelitian ini dilakukan dengan pelarut organik yang akan mengendapkan protein sehingga obat akan lepas dari ikatan protein dan tertarik ke dalam pelarut organik. Hasil yang didapatkan pelarut organik yang digunakan adalah pentana yang memberikan luas puncak sebesar 52124 µAU untuk konsentrasi 1 µg/mL. Pemilihan pentana sebagai pengendap protein sekaligus pengekstraksi MPA karena pentana mampu memberikan perolehan kembali yang baik.
Validasi metode penetapan kadar MPA dalam plasma in vitro
dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa metode tersebut akurat dan
dapat digunakan sebagai metode penetapan kadar secara in vivo. Validasi
metode yang dilakukan adalah validasi sebagian dengan mempertimbangkan bahwa metode yang dilakukan pada penelitian ini merupakan modifikasi dari
metode yang telah dilakukan sebelumnya. Parameter validasi yang dilakukan meliputi liniearitas, limit deteksi dan limit kuantitasi, selektivitas, akurasi, presisi, dan perolehan kembali.
Liniearitas merupakan kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Dari percobaan dibuat larutan standar MPA dalam plasma dengan rentang konsentrasi 1-5 µg/mL, dan didapat hasil persamaan garis regresi linier y = 37863,3 + 14398,5 x dengan koefisien korelasi (r) sebesar 0,99888246 dan koefisien fungsi regresi 2,88%. Untuk penetapan kadar dalam sediaan biologis disyaratkan bahwa koefisien fungsi regresi di bawah 5%, sehingga kurva kalibrasi yang diperoleh telah memenuhi persyaratan.
Langkah selanjutnya adalah penetapan batas deteksi dan batas kuantitasi dari sampel. Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibanding dengan blangko. Sedangkan batas kuantitasi merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria akurat dan seksama. Hasil dari uji batas deteksi ini adalah 0,259 µg/mL dan batas kuantitasi sebesar 0,864 µg/mL.
Uji selektivitas dilakukan untuk mengetahui bahwa metode yang ditetapkan kemampuannya hanya untuk mengukur zat tertentu saja dengan cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Uji ini dilakukan terhadap sampel dengan konsentrasi 1 g/mL. Persyaratan untuk uji selektivitas ini adalah nilai koefisien variasinya
pengujian selektivitas pada sampel adalah koefisien variasi sebesar 0,41% dan
% diff sebesar -4,92%, hasil ini telah memenuhi persyaratan untuk uji selektivitas.
Uji akurasi dilakukan untuk mengetahui kedekatan hasil penetapan yang diperoleh dengan hasil sebenarnya. Akurasi diperiksa dengan
menghitung perbedaan nilai yang terukur dengan nilai sebenarnya (% diff) Uji
akurasi dilakukan dengan menetapkan kadar sampel pada 3 konsentrasi yaitu 2
µg/mL, 3 µg/mL, dan 4 µ g/mL. Persyaratan yang ditentukan adalah % diff≤
20% untuk konsentrasi rendah, dan ≤ 15% untuk konsentrasi sedang dan
tinggi. Pada konsentrasi 2 g/mL didapatkan hasil % diff rata-rata sebesar -
3,97%, konsentrasi 3 g/mL didapatkan % diff rata-rata sebesar 0,797% dan
pada konsentrasi 4 g/mL didapatkan % diff rata-rata sebesar 0,64%.
Kemudian dihitung pula nilai perolehan kembalinya (% recovery) dengan cara
membandingkan konsentrasi medroksiprogesteron asetat dalam plasma yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan konsentrasi medroksiprogesteron asetat yang sebenarnya dikalikan dengan 100%. Perolehan kembali disyaratkan pada
rentang 98–102% untuk sediaan farmasi dan jika dalam sampel biologis
menjadi ± 10% dari persyaratan tersebut. Nilai uji perolehan kembali pada konsentrasi 2 g/mL berkisar 96,03%, konsentrasi 3 g/mL berkisar 100,79% dan pada konsentrasi 4 g/mL sekitar 100,64%. Pengujian perolehan kembali ini dilakukan pada tiga konsentrasi dengan tujuan untuk memberikan batas range bahwa konsentrasi analit yang terukur pada daerah tersebut masih terukur dengan baik oleh detektor. Hasil untuk uji akurasi dan perolehan kembali ini telah memenuhi persyaratan uji pada sediaan biologis.
Presisi adalah ukuran yang menunjukan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel. Uji presisi dilakukan intra- hari dan inter-hari, pada konsentrasi rendah 2 g/mL didapat koefisien variasi sebesar 0,52%, pada konsentrasi sedang 3 g/mL diperoleh koefisien variasi sebesar 0,27% dan pada konsentrasi tinggi 4 g/mL didapat koefisien variasi sebesar 0,39%. Pengukuran inter-hari yang dilakukan selama 2 hari berturut-
turut didapat hasil koefisien variasi ≤ 20% untuk konsentrasi rendah dan tidak
≥ 15% untuk konsentrasi sedang dan tinggi. Pada uji presisi ini, hasil tersebut telah memenuhi syarat untuk uji presisi pada sediaan biologis. Uji dilakukan pada intra-hari dan inter-hari untuk memastikan bahwa setelah sediaan disimpan masih stabil dan tidak mengganggu hasil analisa.
Hasil dari parameter-parameter validasi metode analisis yang telah dilakukan secara keseluruhan telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan untuk pengujian pada sediaan biologis. Hal ini menunjukan bahwa metode
analisis medroksiprogesteron asetat dalam plasma in vitro valid dan dapat