Hasil dan Pembahasan .1 Isolasi DNA Genom pada Enam Genotipe Gandum .1 Isolasi DNA Genom pada Enam Genotipe Gandum

TOLERANSI SUHU TINGGI PADA GANDUM (Triticum aestivum L.)

5.3 Hasil dan Pembahasan .1 Isolasi DNA Genom pada Enam Genotipe Gandum .1 Isolasi DNA Genom pada Enam Genotipe Gandum

DNA gandum yang telah diisolasi kemudian diperiksa konsentrasinya menggunakan nanodrop. Konsentrasi DNA gandum setiap genotipe dapat dilihat

pada Tabel 5.3. DNA yang berhasil diisolasi dari semua genotipe gandum secara umum memiliki konsentrasi yang tinggi. Konsentrasi DNA tertinggi terdapat pada genotipe Dewata (536.68 ng/μl) dan terendah pada SBR (184.73 ng/μl). DNA

yang memiliki konsentrasi tinggi mengindikasikan bahwa jumlah molekul DNA yang diperoleh per volumenya banyak. Artinya, dengan sedikit volume DNA yang diambil dari larutan stok sudah cukup digunakan untuk membuat working solution dibandingkan dengan DNA yang memiliki konsentrasi rendah, sehingga pengenceran dapat dilakukan berkali-kali lebih banyak. Konsentrasi DNA yang tinggi pada sampel didukung dengan kualitas DNA yang baik, ditunjukkan dengan hasil pengecekan DNA genom menggunakan elektroforesis yang tampak terang (Gambar 5.1).

Tabel 5.3 Konsentrasi DNA genom pada enam genotipe gandum

Gambar 5.1 Hasil elektroforesis DNA genom pada enam genotipe gandum Warna terang pada elektroforesis DNA genom mengindikasikan bahwa DNA yang diisolasi mempunyai kualitas yang baik. Pengecekan kualitas DNA tidak hanya dilakukan dengan elektroforesis DNA genom sampel, tetapi juga menggunakan amplifikasi dengan random primer. Pita yang dihasilkan dari amplifikasi tersebut tampak secara acak dalam genom (Gambar 5.2).

Adanya pita secara acak dalam genom memiliki arti bahwa DNA sampel yang diisolasi dapat diamplifikasi dengan baik oleh random primer, sehingga memungkinkan untuk dilakukan amplifikasi dengan primer spesifik. Jika hasil amplifikasi primer spesifik tidak terdapat pita maka kesalahan tersebut bukan berasal dari kuantitas maupun kualitas DNA yang rendah.

Genotipe Konsentrasi DNA (ng/μl)

Nias 219.72 Dewata 536.68 Guri 5 Agritan 242.74 Guri 3 Agritan 391.32 SBR 184.73 Jarissa 323.25

Gambar 5.2 Elektroforesis hasil amplifikasi enam genotipe gandum menggunakan random primer, (A) primer A2, (B) primer E20 Penelitian Sánchez-Hernández dan Gaytán-Oyarzún (2006) menyebutkan bahwa kegagalan amplifikasi dapat disebabkan oleh adanya metabolit sekunder yang terkandung bersama sampel DNA, sehingga meskipun DNA memiliki kuantitas dan kualitas yang baik belum tentu dapat teramplifikasi dengan baik.

5.3.2 Desain Primer Spesifik dan Amplifikasi Gen terkait Toleransi Suhu Tinggi pada Enam Genotipe Gandum

Hasil desain primer terhadap keempat gen dapat dilihat pada Tabel 5.4. Primer yang telah didesain kemudian digunakan untuk mengamplifikasi gen target pada DNA genom gandum. Amplifikasi menggunakan protokol PCR standard KOD FX pada gen TaHsfA2d, TaHsfC2a, dan TaHSP16.9B tidak menghasilkan pita tunggal seperti yang diinginkan (Gambar 5.3). Optimasi kemudian dilakukan dengan mengubah suhu annealing, waktu elongasi, siklus PCR, dan konsentrasi DNA pada proses PCR.

Tabel 5.4 Pasangan primer spesifik gen terkait toleransi suhu tinggi pada gandum

Nama gen

Primer

forward dan reverse

(5‘-‗3) Tm (^oC) Estimasi ukuran pita (pb) TaHsfA2d ‗CCACGAGGAGGAATGGACCG‘ _59.5 ₁₀₁₂ ‗CCCATACTTTGCGCTACGCG‘ TaHsfC2a ‗TAGAGAGAGACCGATGGCGG‘ _57.7 ₇₈₀ ‗TCGGGCGTCACTACTCAGTA‘ TaHSP16.9B ‗CAGCAATCAACACCACGATG‘ _54.7 ₆₁₁ ‗TGAAAGCTAGTGTCACCAGC‘ TaHSF-2 ‗TCCGTGCCGTCCAACGGTGT‘ 63.5 1190 ‗GCCTGAACCCAGCTCACCTGG‘ ‗AGCACAATAACTTCTCCAGCTTCGTGCGC‘*

Keterangan: *inner primer untuk mengamplifikasi bagian tengah sekuen gen

Hasil amplifikasi gen TaHsfA2d menghasilkan pita dengan ukuran di bawah estimasi yang diharapkan pada genotipe Nias. Pita di bawah ukuran estimasi diduga disebabkan oleh suhu annealing yang digunakan untuk mengamplifikasi terlalu rendah sehingga pita yang dihasilkan tidak spesifik.

M 500 pb 1000 pb 500 pb 1000 pb M A ^B

Primer akan menempel pada daerah genom gandum yang memiliki sekuen nukelotida mirip dengannya secara acak, terutama pada ukuran yang rendah (Saiki 1989). Optimasi yang dilakukan adalah dengan meningkatkan suhu annealing (Ta), yakni sebesar 2 ôC dari 54.5ôC menjadi 56.5ôC.

Gambar 5.3 Hasil amplifikasi gen dengan protokol PCR standard pada gandum, (A) TaHsfA2d, (B) TaHsfC2a, dan (C) TaHSP16.9B; anak panah menunjukkan target amplifikasi

Gen TaHsfC2a yang diamplifikasi juga tidak menghasilkan pita tunggal dengan estimasi ukuran yang diharapkan, namun terdapat sisa produk PCR di bagian bawah gel. Hal tersebut mengindikasikan proses PCR yang tidak sempurna, terutama disebabkan oleh rendahnya konsentrasi primer yang digunakan (Rous 1995). Optimasi pertama yang dilakukan adalah meningkatkan konsentrasi primer dari volume 0.25 μl menjadi 0.4 μl sehingga konsentrasi akhirnya meningkat dari 0.25 μM menjadi 0.4 μM. Selain itu, gen TaHSP16.9B juga tidak menghasilkan pita tunggal setelah amplifikasi. Visualisasi pada gel hasil elektroforesis gen TaHSP16.9B tidak menunjukkan sisa hasil produk PCR maupun hasil amplifikasi pada ukuran lain. Hal pertama yang dilakukan adalah meningkatkan konsentrasi DNA template dan waktu elongasi. Hasil optimasi pertama pada ketiga gen tersebut dapat dilihat pada Gambar 5.4.

Gambar 5.4 Hasil optimasi pertama proses PCR pada gandum, (A) TaHsfA2d, (B) TaHsfC2a, dan (C) TaHSP16.9B ; anak panah menunjukkan target ampifikasi

A B C

71 Hasil optimasi pertama pada gen TaHsfA2d menghasilkan warna terang pada bagian well gel dan pita tipis pada ukuran di atas estimasi yang diharapkan. Adanya pita pada ukuran di atas estimasi diduga terdapat intron di dalam gen tersebut. Pita tipis pada ukuran yang diprediksi sebagai daerah target mengindikasikan jumlah siklus PCR yang kurang. Siklus PCR kemudian ditambah sebanyak 10 siklus menjadi 45 siklus. Selain itu, penambahan waktu elongasi juga dilakukan sebanyak 10 detik dari 60 detik menjadi 70 detik. Tidak adanya pita pada hasil elektroforesis gen TaHsfC2a dan TaHSP16.9B dapat disebabkan oleh konsentrasi DNA template yang terlalu rendah, suhu annealing yang terlalu tinggi, waktu elongasi yang terlalu pendek, jumlah siklus yang kurang, konsentrasi enzim Taq Polymerase yang rendah, serta desain primer yang kurang spesifik (Radstrom et al. 2003). Amplifikasi gen TaHsfC2a kemudian dilakukan dengan meningkatkan konsentrasi DNA dan menambah waktu elongasi. Peningkatan konsentrasi DNA dan waktu elongasi pada gen TaHSP16.9B tidak menunjukkan perubahan pada hasil elektroforesis, sehingga selanjutnya suhu annealing diturunkan sebanyak 2ôC dari 49.7ôC menjadi 47.7ôC. Penambahan jumlah siklus PCR dan peningkatan konsentrasi enzim Taq Polymerase juga dilakukan pada optimasi selanjutnya pada gen TaHsfC2a dan TaHSP16.9B, namun hasil yang didapatkan tetap sama yakni tidak ada pita. Hasil optimasi kedua pada gen TaHsfA2d juga tidak menghasilkan pita dan tampak smear di sekitar well. Beberapa dugaan terkait tidak teramplifikasinya ketiga gen tersebut dapat berupa kurang spesifiknya primer yang dirancang sehingga menyebabkan penempelan secara acak pada sekuen yang mirip di semua genom gandum, serta terjadinya secondary structure pada primer seperti dimer dan hairpin. Proses optimasi yang dilakukan pada ketiga gen tersebut dapat dilihat pada Tabel 5.5. Tabel 5.5 Optimasi PCR gen TaHsfA2d, TaHsfC2a, dan TaHSP16.9B gandum

Optimasi

dan hasil ^TaHsfA2d ^TaHsfC2a ^TaHSP16.9B

Hasil amplifikasi pertama

Terdapat pita di bawah ukuran estimasi

Terdapat sisa produk PCR di bawah gel (smear)

Tidak terdapat pita sama sekali Optimasi 1 Meningkatkan Ta sebanyak 2 derajat Meningkatkan konsentrasi primer Meningkatkan konsentrasi DNA dan waktu elongasi Hasil optimasi 1 ^{Pita di atas ukuran}

estimasi dan tipis

Tidak terdapat pita sama sekali

Tidak terdapat pita sama sekali Optimasi 2 Meningkatkan siklus PCR dan waktu elongasi Meningkatkan konsentrasi DNA dan waktu elongasi

Menurunkan Ta sebanyak 2 derajat Hasil optimasi 2 ^{Pita tipis dan}^smear ^{Tidak terdapat pita}

sama sekali

Tidak terdapat pita sama sekali Optimasi 3 ^{Menambah volume}

dNTPs

Menambah jumlah siklus PCR

Menambah jumlah siklus PCR Hasil optimasi 3 ^Smear^{pada bagian}

sekitar well

Tidak terdapat pita sama sekali

Tidak terdapat pita sama sekali Optimasi 4 ^Mengurangi konsentrasi DNA Meningkatkan konsentrasi enzim Meningkatkan konsentrasi enzim Hasil optimasi 4 ^Smear^{pada bagian}

sekitar well

Tidak terdapat pita sama sekali

Pita tunggal diperoleh pada hasil amplifikasi pertama gen TaHSF-2 dengan ukuran + 1300 pb (Gambar 5.5). Dengan demikian, gen yang terpilih untuk dilanjutkan analisis berikutnya adalah TaHSF-2. Purifikasi pita dari gel dan perunutan nukleotida kemudian dilakukan. Ukuran pita hasil amplifikasi gen tersebut berada di atas estimasi yang diharapkan karena terdapat intron dengan panjang 107 pb pada situs nomor urutan 271 sampai 378 terhitung dari basa A start codon (ATG) setelah dilakukan perunutan nukleotida.

Gambar 5.5 Hasil elektroforesis gen TaHSF-2 keenam genotipe gandum; anak panah menunjukkan ukuran target amplifikasi

Hasil perunutan nukleotida yang diperoleh pada gen TaHSF-2 tersebut berbeda-beda panjangnya, yaitu Nias (1284 pb), Dewata (1285 pb), Guri 5 Agritan (1270 pb), Guri 3 Agritan (1268 pb), SBR (1271 pb), dan Jarissa (1270 pb).

5.3.3 Karakterisasi dan Analisis Filogenetik Sekuen Nukleotida Gen terkait Toleransi Suhu Tinggi Hasil Amplifikasi pada Enam Genotipe Gandum Analisis pensejajaran runutan basa nukleotida gen TaHSF-2 yang diperoleh dari keenam genotipe gandum menunjukkan tingkat homologi yang tinggi dengan sekuen referensinya yaitu pada aksesi nomor KP063542.1, gandum genotipe HD2967 di India. Selain itu, hasil pensejajaran runutan basa nukleotida yang dilakukan menggunakan program BLAST pada GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov/) menunjukkan bahwa sekuen gen TaHSF-2 yang diperoleh memiliki kesamaan yang tinggi dengan Hordeum vulgare (AK373036.1), Oryza sativa (XM_015793233.1), Oryza rufipogon (CU406884.1), Oryza brachyantha (XM_006659593.2), Setaria italica (XM_004974057.3), Brachypodium distachyon (XM_003578430.3), Musa acuminata (XM_009401730.1), Elaeis guineensis (XM_010936168.1), Phoenix dactylifera (XM_008802571.1), Carica papaya (AB506766.1), Pyrus bretschneideri (XM_009348121.1), Malus domestica (XM_008342519.1), dan Fragaria vesca (XM_004300174.2) (Gambar 5.6).

73 Analisis hasil prediksi asam amino pada keenam genotipe gandum juga memiliki tingkat kesamaan sekitar 88-100% dari gen yang diharapkan, serta tingkat kesamaan yang tinggi dengan asam amino gen HSF pada spesies lain (Tabel 5.6). Gen TaHSF-2 terdiri dari dua ekson yang seluruhnya menyandi 375 asam amino, dengan 90 asam amino di bagian pertama (sebelum intron), dan 285 asam amino di bagian kedua (setelah intron) (Gambar 5.7). Berdasarkan database gandum (https://urgi.versailles.inra.fr/), gen TaHSF-2 yang diamplifikasi berada pada kromosom nomor 7 pada genom A.

Gambar 5.6 Dendrogram hasil analisis filogenetik sekuen nukleotida gen TaHSF-2 dari enam genotipe gandum berdasarkan analisis pensejajaran menggunakan ClustalX dan dibuat berdasarkan metode UPGMA. Angka pada sumbu percabangan adalah nilai bootstrap (1000 ulangan), skala mewakili panjang cabang yang setara dengan rataan substitusi basa nukleotida per situs.

Analisis filogenetik gen HSF dari berbagai spesies hasil BLAST membagi dua kelompok besar tanaman, yakni monokotil dan dikotil. Sub kelompok pertama gen HSF yang berasal dari golongan tanaman monokotil diketahui merupakan dari famili Poaceae. Gen TaHSF-2 dari genotipe gandum yang digunakan memiliki runutan basa nukleotida yang mirip dengan sekuen referensinya yaitu gandum genotipe HD2967.

Hasil analisis pensejajaran prediksi asam amino keenam genotipe gandum menunjukkan homologi yang tinggi dengan asam amino pada gen HSF spesies lain, terutama teridentifikasi sebagai gen HsfB2. Gen HsfB2 yang memiliki homologi tinggi tersebut berdasarkan BLASTn dapat ditemukan spesifik pada

Nias

Triticum aestivum (var.HD2967) Dewata Guri 3 Agritan SBR Guri 5 Agritan Jarissa Hordeum vulgare Setaria italica Oryza brachyantha Oryza rufipogon Oryza sativa Brachypodium distachyon Musa acuminata Elaeis guineensis Phoenix dactylifera Carica papaya Fragaria vesca Malus domestica Pyrus bretschneideri 100 59 46 76 61 98 100 100 100 100 100 100 87 98 99 70 100 0 50 100 150 Poaceae Monokotil Dikotil

spesies Aegilops tauschii (EMT20815.1), Oryza brachyantha (XP_006659656.1), Oryza sativa (Q6Z9C8.1), Brachypodium distachyon (XP_010235376.1), dan Phoenix dactylifera (XP_008800793.1), serta asam amino HsfB2c seperti pada Setaria italica (XP_004957414.1)dan Elaeis guineensis (XP_010933854.1). Nilai similarity ditunjukkan pada kolom identity yang memperlihatkan persentase homologi yang cukup tinggi, yakni di atas 50%.

Tabel 5.6 Sequence identity residu prediksi asam amino dari TaHSF-2 yang diisolasi dari enam genotipe gandum dan HSF dari tanaman lain yang terdeposit di GenBank

Aksesi Deskripsi ^Query

cover ^{E value} ^Ident. AJR10106.1 ^{Heat-responsive transcription}

factor Triticum aestivum 88-99% 0 88-100% EMT20815.1 ^{Heat stress transcription factor}

B2-b Aegilops tauschii 88-99% 0 84-93%

BAK04233.1 ^{Heat schock factor protein}

Hordeum vulgare 87-99% 4E^-179 - 0 82-92% XP_006659656.1 ^{Heat stress transcription factor}

B2-b Oryza brachyantha 76-93% 2E^-156 - 1E^-129 70-72% Q6Z9C8.1 ^{Heat stress transcription factor}

B2-b Oryza sativa 82-94% 4E^-143 - 2E^-118 65-72% XP_008677301.1 ^{Heat shock factor protein 7}

Zea mays 82-98% 2E^-135 - 6E^-115 66-69% XP_004957414.1 ^{Heat stress transcription factor}

B-2c Setaria italica 81-93% 6E^-127 - 5E^-109 60-64% XP_010235376.1 ^{Heat stress transcription factor}

B2-b Brachypodium distachyon 81-95% 6E^-117 - 7E^-102 61-64% XP_008800793.1 ^{Heat stress transcription factor}

B2-b Phoenix dactylifera 83-95% 5E^-110 - 5E^-99 57-61% XP_010933854.1 ^{Heat stress transcription factor}

B2-c Elaeis guineensis 83-92% 3E^-109 - 1E^-100 54-56%

Start codon hasil perunutan nukleotida gandum diawali dengan asam amino MGEQ. Motif serupa juga dijumpai pada HsfB2b Aegilops tauschii, sedangkan pada Oryza sativa diawali dengan MADQ (Kikuchi et al. 2008). Berdasarkan prediksi runutan asam amino yang didapatkan dari gen TaHSF-2 tersebut, ditemukan tiga motif penting gen HsfB pada umumnya (Gambar 5.7). Motif pertama adalah adanya asam amino F, LP, KH, N, SF, RQLN, dan Y yang merupakan DNA binding domain (DBD). DBD merupakan domain terkonservasi HSF, merupakan penciri utama HSF secara umum. Domain ini terdiri atas 3-helical bundle (H1, H2, H3) serta sebuah 4-stranded antiparalel β-sheet (β1, β2, β3, β4). Inti hidrofobik pada domain ini menjadikan adanya posisi central helix -turn-helix motif (H2-T-H3) yang dibutuhkan dalam mengenali Heat Shock element (HSE) (Nover et al. 2001). HSE dicirikan dengan adanya runutan

nukleotida yang tersusun atas 5‘-nGAAnnTTCnnGAAn-3‘, sebagai promotor

terkonservasi gen-gen inducible suhu tinggi pada semua jenis eukariot (Wu et al. 1995). Struktur ini dijumpai pada gen TaHSF-2 pada bagian ujung N-terminus, 105 pb setelah TATA box dan 59 bp sebelum start codon, dalam hal ini bagian tersebut tidak ikut teramplifikasi karena desain primer (forward) dilakukan setelah

75 HSE dan sebelum start codon yang disesuaikan dengan sekuen gen referensi dengan nomor aksesi KP063542.1 (Gambar 5.8).

Nias ----CAVGGGGV-MGEQAAAVSSGETPATAEVGTGLGQRSLPTPFLNKTYQLVDDPAVDDVISWSEDGSA

Dewata ----CAVGGGGV-MGEQAAAVSSGETPATAEVGTGLGQRSLPTPFLNKTYQLVDDPAVDDVISWSEDGSA

Guri 5 Agr ----CAVGGGGV-MGEQAAAVSSGETPATAEVGTGLGQRSLPTPFLNKTYQLVDDPAVDDVISWSEDGSA

Guri 3 Agr ---GGGGV-MGEQAAAVSSGETPATAEVGTGLGQRSLPTPFLNKTYQLVDDPAVDDVISWSEDGSA

SBR PWTICAVGGGGV-MGEQAAAVSSGETPATAEVGTGLGQRSLPTPFLNKTYQLVDDPAVDDVISWSEDGSA

Jarissa ---VGGGDGAMGEQAAAVSSCETPAPAEVGTGVGQRSLPTPFLNKTYQLVDDPAVDDVISWSEDGSA

***...**********.****.******.**********************************

Nias FIVWRPAEFARDLLPKYFKHNNFSSFVRQLNTYGFRKIVPDRWEFANDCFRRGEKRLLCDIHRRKVTPTV

Dewata FIVWRPAEFARDLLPKYFKHNNFSSFVRQLNTYGFRKIVPDRWEFANDCFRRGEKRLLCDIHRRKVTPTV

Guri 5 Agr FIVWRPAEFARDLLPKYFKHNNFSSFVRQLNTYGFRKIVPDRWEFANDCFRRGEKRLLCDIHRRKVTPTV

Guri 3 Agr FIVWRPAEFARDLLPKYFKHNNFSSFVRQLNTYGFRKIVPDRWEFANDCFRRGEKRLLCDIHRRKVTPTV

SBR FIVWRPAEFARDLLPKYFKHNNFSSFVRQLNTYGFRKIVPDRWEFANDCFRRGEKRLLCDIHRRKVTPTV

Jarissa FIVWRPAEFARDLLPQYFQPNNFSRFVRPLTPYGFRKIVPDRWEFANDCFRRGEKRLLCDIHRRKVTPTV

***************.**..****.***.*..**************************************

Nias AATAAVTVAAAAAIPVALPVAKRQGSPVLSGDEQVLSSSSSPEPPFLNQYAPSYSGSGGVASGDLGEENE

Dewata AATAAVTVAAAAAIPVALPVAKRQGSPVLSGDEQVLSSSSSPEPPFLNQYAPSYSGSGGVASGDLGEENE

Guri 5 Agr AATAAVTVAAAAAIPVALPVAKRQGSPVLSGDEQVLSSSSSPEPPFLNQYAPSYSGSGGVASGDLGEENE

Guri 3 Agr AATAAVTVAAAAAIPVALPVAKRQGSPVLSGDEQVLSSSSSPEPPFLNQYAPSYSGSGGVASGDLGEENE

SBR AATAAVTVAAAAAIPVALPVAKRQGSPVLSGDEQVLSSSSSPEPPFLNQYAPSYSGSGGVASGDLGEENE

Jarissa AATAAVTVAAAAAIPVALPVAKRQGSPVLSGDEQVLSSSSSPEPPFLNQYAPSYSGSGGVASGDLGEENE

**********************************************************************

Nias RLRRENSRLTRELGQMKKLCNNIFVLMSKYTDGQQTDAANATSAAADVGNCSGESAETTALPPPPVLELL

Dewata RLRRENSRLTRELGQMKKLCNNIFVLMSKYTDGQQTDAANATSAAADVGNCSGESAETTALPPPPVLELL

Guri 5 Agr RLRRENSRLTRELGQMKKLCNNIFVLMSKYTDGQQTDAANATSAAADVGNCSGESAETTALPPPPGLEFM

Guri 3 Agr RLRRENSRLTRELGQMKKLCNNIFVLMSKYTDGQQTDAANATSAAADVGNCSGESAETTALPPPPVLELL

SBR RLRRENSRLTRELGQMKKLCNNIFVLMSKYTDGQQTDAADASSAAADVGNSSGESAETTALPPPPVLELL

Jarissa RLRRENSRLTRELGQMKKLCNNIFVLMSKYTDGQQTDAANETSAAADVGNCSGESAETTALPPPPVLELL

***************************************...********.**************.**..

Nias PSCQNAPTAADLGAEDEEEKMSARLFGVCIGRKRMRHDGEDRTRRGAAAEVKPEPMDAQQPSGMDGHTPD

Dewata PSCPNAPTAADLGAEDEEEKMSARLFGVCIGRKRMRHDGEDRTRRGAAAEVKPEPMDAQQPSGMDGHTPD

Guri 5 Agr PSGPNAPTAADLGAEDEEEKMSARLFGVCIGRKRMRHDGEDRTRRGAAAEVKPEPMNAQQPSGMAVTHRT

Guri 3 Agr PSCQNAPTAADLGAEDEEEKMSARLFGVCIGRKRMRHDGEDRTRRGAAAEVKPEPMDAQQPSGMDGHTPD

SBR PSCPNAPTAADLGAEDEEEKMSARLFGVCIGRKRMRHDGEDRTRRGAAAEVKPEPMNAQQPSGMAVTHRT

Jarissa PSCPNAPTAADLGAEDEEEKMSARLFGVCIGRKRMRHDGEDRTRRGAAAEVKPEPMNAQQPSGMAVTHRT

**..****************************************************.********...

Nias VQAWPIYRPRPVYQPLRASDGSNCYSGSDDHNGSNSR*AQLKKE*DT

Dewata VQAWPIYRPRPVYQPLRASDGSNCYSGSDDHNGSNSR*AQLKKE*DH

Guri 5 Agr CKPGPFTGPDPCTNPSAPPTGQTATAGVTTTTGPTPGELSSK---

Guri 3 Agr VQAWPIYRPRPVYQPLRASDGSNCYSGSDDHNGSNSR*AQLKKR---

SBR CSLAHLQAQTRVPTPPRLRRVKLLQRE*RPQRVQLQGA---

Jarissa CKPGPFTGPDCTNPSAPPTGQTATAGVTTTTGPTPGELSSKK---

...

Gambar 5.7 Hasil pensejajaran prediksi asam amino dari hasil amplifikasi PCR gen TaHSF-2 menggunakan primer spesifik. Asam amino dalam kotak menunjukkan motif-motif penting gen HSF yang ditemukan

1 CGCCCTCGGGTTTATAGCTTCCCCCTCCGCAACTGCCGCTGCCTCCCCTACTCCTCCGTTCCTTCGTCTC 71 GTCGCGTTTCCGTCTCTAACTTCCTCGCTTCTCTCCACGCTACGCTATCCGGAACCTTCCGGAAGGTTGC 141 TTTGACACCCCCCCTTCCGTGCCGTCCAACGGTGTCGCCGGGACAGATCTGCGCTGTCGGCGGCGGCGGC 211 GTCATGGGCGAGCAGGCCGCGGCCGTTTCCTCCGGCGAGACGCCTGCCACGGCGGAGGTGGGGACA....

Gambar 5.8 Posisi HSE dalam runutan nukleotida gen referensi gandum genotipe HD2967, berturut-turut: TATA box, sekuen HSE, forward primer, dan start codon.

Motif kedua adalah daerah OD (Oligomerization Domain) yang terdiri atas HR-A dan HR-B, yang ditandai dengan adanya asam amino F, I, M, L, dan V. Struktur ini terdiri dari residu asam amino hidrofobik dengan pola bipartit heptad. Komposisi asam amino L penciri OD dilaporkan oleh Scharf et al. (2012) dengan

runutan L6aaL6aaL6aaL4aa_linker_2aa_MMSFLAKAV pada SlHsfA1a. Linker berupa asam amino yang menghubungkan daerah HR-A dengan HR-B, yaitu sebanyak 21 asam amino pada HsfA, 7 asam amino pada HsfC, dan tanpa linker pada HsfB, sedangkan asam amino MMSFLAKAV merupakan HR-B. HR-B berbeda komposisi untuk setiap sub anggota HSF dan jenis spesies. Gen TaHSF-2 yang digunakan dalam penelitian ini juga ditemukan OD dengan struktur L6aaL6aaL6aaM_KKLC_tanpa linker_NN_IFVLMSKYT. Struktur OD pada HsfB bersifat padat dan kompak karena tidak terdapat insersi (linker) di dalamnya, struktur ini lebih mirip dengan gen HSF non tanaman. Stuktur OD yang berbentuk coiled-coin (protein menggulung) mirip dengan protein bertipe zipper ini berfungsi sebagai agen trimerisasi (Peteranderl et al. 1999). Secara umum, struktur gen Hsf(A) dapat dilihat pada Gambar 5.9.

Gambar 5.9 Struktur dasar gen HSF (Sumber : Nover et al. 2001)

Berdasarkan Gambar 5.9, terdapat 5 motif penting gen HSF, yaitu DBD yang ditandai dengan asam amino F, LP, KH, N, SF, dan RQLN, kemudian HR-A/B oleh asam amino I, M, dan L. Dilanjutkan dengan NLS (lokalisasi) yang dicirikan banyaknya asam amino K dan R, lalu AHA1 dan AHA2 sebagai aktivator peptide yang tersusun atas asam amino aromatik (W, F, Y), hidrofobik (L, I, V), dan acidic (D, E) secara repetitif, serta motif NES dengan berulangnya asam amino leusin di ujung dekat stop codon (Nover et al. 2001, Baniwal et al. 2004). Anak panah menunjukkan adanya intron yang menghubungkan DBD dengan HR-A/B. Contoh di atas merupakan model HSF yang diambil dari tanaman tomat, yaitu gen LpHsfA2.

Berbeda dengan HsfA, HsfB tidak memiliki motif AHA dan NES pada bagian C-terminusnya (Gambar 5.10). Hal ini disebabkan oleh fungsi dari HsfB sebagai repressor yang menekan ekspresi dari HsfA. Fungsi tersebut ditandai dengan adanya motif LFGV pada C-terminus, disebut sebagai BRD (B3 Repressor Domain) sebagai lokalisasi atau NLS (Ikeda dan Takagi 2009). Motif tersebut telah diteliti pada berbagai spesies termasuk Arabidopsis, padi, kedelai, tomat, dan tembakau dan menghasilkan pensejajaran motif LFGV yang

77 terkonservasi (Ikeda et al. 2011). Asam amino LFGV ditemukan dalam TaHSF-2 yang diamplifikasi pada percobaan ini.

Gambar 5.10 Struktur gen HsfB (A) pensejajaran dengan beberapa gen HSF lain yang menunjukkan domain penting, (B) pensejajaran asam amino antar spesies

(Sumber : Ikeda et al. 2011)

Perunutan nukleotida hasil amplifikasi gen TaHSF-2 pada keenam genotipe gandum menunjukkan beberapa keragaman, terutama pada genotipe Guri 5 Agritan, SBR, dan Jarissa (Gambar 5.11). Genotipe Jarissa ditemukan terdapat beberapa nukleotida yang tidak sesuai dengan gen referensi (15 nukleotida), termasuk substitusi dan inversi. Sementara itu, keragaman nukleotida pada genotipe Guri 5 Agritan dan SBR ditemukan pada posisi sekitar 440-520 pb setelah intron, masing-masing sebanyak 4 dan 5 nukleotida. Hal ini mengindikasikan adanya perbedaan runutan nukleotida dalam gen. Perbedaan runutan nukleotida dalam gen umum ditemui dan menunjukkan keragaman dalam spesies, namun perbedaan tersebut dapat juga merupakan copy gen yang berbeda dalam genom yang berbeda karena gandum merupakan tanaman heksaploid yang memiliki tiga genom. Susunan nukleotida gen dalam genom yang berbeda pada gandum memiliki beberapa pasang basa yang berbeda, ditemui pada gen Pm3b terkait resistensi terhadap powdery mildew (Yahiaoui et al. 2004).

Nias TCCGTGCCGTCCAACGGTGT---TGCGCTGT---CGGCGGCGGCGGCGTCATGGGCGAGCAGGCCGCGGCC

Dewata TCCGTGCCGTCCAACGGTGT---TGCGCTGT---CGGCGGCGGCGGCGTCATGGGCGAGCAGGCCGCGGCC

Guri 5 Agr TCCGTGCCGTCCAACGGTGT---TGCGCTGT---CGGCGGCGGCGGCGTCATGGGCGAGCAGGCCGCGGCC

Guri 3 Agr TCCGTGCCGTCCAACGGTGT---T---CGGCGGCGGCGGCGTCATGGGCGAGCAGGCCGCGGCC

SBR TCCGTGCCGTCCAACGGTGTCGCCGTGGACGATCTGCGCTGT---CGGCGGCGGCGGCGTCATGGGCGAGCAGGCCGCGGCC

Jarissa TCCGTGCCGTCCAACGGTGT---TGTCGGCGGCGGCGACGGCGCCATGGGCGAGCAGGCCGCGGCC

...*...********.*****.**********************

Nias GTTTCCTCCGGCGAGACGCCTGCCACGGCGGAGGTGGGGACAGGGCTGGGGCAGAGGTCGCTGCCCACGCCGTTCCTGAACA

Dewata GTTTCCTCCGGCGAGACGCCTGCCACGGCGGAGGTGGGGACAGGGCTGGGGCAGAGGTCGCTGCCCACGCCGTTCCTGAACA

Guri 5 Agr GTTTCCTCCGGCGAGACGCCTGCCACGGCGGAGGTGGGGACAGGGCTGGGGCAGAGGTCGCTGCCCACGCCGTTCCTGAACA

Guri 3 Agr GTTTCCTCCGGCGAGACGCCTGCCACGGCGGAGGTGGGGACAGGGCTGGGGCAGAGGTCGCTGCCCACGCCGTTCCTGAACA

SBR GTTTCCTCCGGCGAGACGCCTGCCACGGCGGAGGTGGGGACAGGGCTGGGGCAGAGGTCGCTGCCCACGCCGTTCCTGAACA

Jarissa GTTTCCTCCTGCGAGACGCCTGCTCCGGCGGAGGTGGGGACAGGGGTCGGGCAGAGGTCGCTGCCCACGCCGTTCTTGAACA

*********.*************..********************.*.***************************.******

Nias AGACGTATCAGCTGGTGGACGACCCGGCGGTCGACGATGTCATCTCGTGGAGCGAGGACGGGTCGGCGTTCATCGTGTGGCG

Dewata AGACGTATCAGCTGGTGGACGACCCGGCGGTCGACGATGTCATCTCGTGGAGCGAGGACGGGTCGGCGTTCATCGTGTGGCG

Guri 5 Agr AGACGTATCAGCTGGTGGACGACCCGGCGGTCGACGATGTCATCTCGTGGAGCGAGGACGGGTCGGCGTTCATCGTGTGGCG

Guri 3 Agr AGACGTATCAGCTGGTGGACGACCCGGCGGTCGACGATGTCATCTCGTGGAGCGAGGACGGGTCGGCGTTCATCGTGTGGCG

SBR AGACGTATCAGCTGGTGGACGACCCGGCGGTCGACGATGTCATCTCGTGGAGCGAGGACGGGTCGGCGTTCATCGTGTGGCG

Jarissa AGACGTACCAGCTGGTGGATGACCCGGCGGTCGACGATGTCATCTCGTGGAGCGAGGACGGGTCGGCGTTCATCGTGTGGCG

*******.***********.**************************************************************

Nias CCCCGCCGAGTTCGCGCGCGACCTCCTCCCCAAGTACTTCAAGCACAATAACTTCTCCAGCTTCGTGCGCCAACTCAACACC

Dewata CCCCGCCGAGTTCGCGCGCGACCTCCTCCCCAAGTACTTCAAGCACAATAACTTCTCCAGCTTCGTGCGCCAACTCAACACC

Guri 5 Agr CCCCGCCGAGTTCGCGCGCGACCTCCTCCCCAAGTACTTCAAGCACAATAACTTCTCCAGCTTCGTGCGCCAACTCAACACC

Guri 3 Agr CCCCGCCGAGTTCGCGCGCGACCTCCTCCCCAAGTACTTCAAGCACAATAACTTCTCCAGCTTCGTGCGCCAACTCAACACC

SBR CCCCGCCGAGTTCGCGCGCGACCTCCTCCCCAAGTACTTCAAGCACAATAACTTCTCCAGCTTCGTGCGCCAACTCAACACC

Jarissa CCCCGCCGAGTTCGCGCGCGACCTTCTCCCCCAGTACTTCCAGCCCAATAACTTCTCCCGCTTCGTGCGCCCGCTCACCCCC

************************.***************.***.*************.************..****.*.**

Nias TACgtaagtgg-gtgctcgtcttccatttccgcgcaacttgatccggactagtagtacatttttgttggtgtcgccggaatg

Dewata TACgtaagtgg-gtgctcgtcttccatttccgcgcaacttgatccggactagtagtacatttttgttggtgtcgccggaatg

Guri 5 Agr TACgtaagtgg-gtgctcgtcttccatttccgcgcaacttgatccggactagtagtacatttttgttggtgtcgccggaatg

Guri 3 Agr TACgtaagtgg-gtgctcgtcttccatttccgcgcaacttgatccggactagtagtacatttttgttggtgtcgccggaatg

SBR TACgtaagtgg-gtgctcgtcttccatttccgcgcaacttgatccggactagtagtacatttttgttggtgtcgccggaatg

Jarissa TACgtaagtggagtgctcgtcttccatttccgcgcaacttgatccggactagtagtacatttttgttggtgtcgccggaatg

***********.**********************************************************************

Nias tcgaggtgctcatgggcgtgctggtgcagGGATTTAGGAAGATTGTGCCGGACAGGTGGGAGTTCGCCAACGACTGCTTCCG

Dewata tcgaggtgctcatgggcgtgctggtgcagGGATTTAGGAAGATTGTGCCGGACAGGTGGGAGTTCGCCAACGACTGCTTCCG

Guri 5 Agr tcgaggtgctcatgggcgtgctggtgcagGGATTTAGGAAGATTGTGCCGGACAGGTGGGAGTTCGCCAACGACTGCTTCCG

Guri 3 Agr tcgaggtgctcatgggcgtgctggtgcagGGATTTAGGAAGATTGTGCCGGACAGGTGGGAGTTCGCCAACGACTGCTTCCG

SBR tcgaggtgctcatgggcgtgctggtgcagGGATTTAGGAAGATTGTGCCGGACAGGTGGGAGTTCGCCAACGACTGCTTCCG

Jarissa tcgaggtgctcatgggcgtgctggtgcagGGATTTAGGAAGATTGTGCCGGACAGGTGGGAGTTCGCCAACGACTGCTTCCG

**********************************************************************************

Nias TCGAGGAGAAAAGCGGCTGCTTTGTGACATACATCGGCGAAAGGTGACGCCGACGGTGGCGGCCACCGCCGCGGTCACGGTA

Dewata TCGAGGAGAAAAGCGGCTGCTTTGTGACATACATCGGCGAAAGGTGACGCCGACGGTGGCGGCCACCGCCGCGGTCACGGTA

Guri 5 Agr TCGAGGAGAAAAGCGGCTGCTTTGTGACATACATCGGCGAAAGGTGACGCCGACGGTGGCGGCCACCGCCGCGGTCACGGTA Guri 3 Agr TCGAGGAGAAAAGCGGCTGCTTTGTGACATACATCGGCGAAAGGTGACGCCGACGGTGGCGGCCACCGCCGCGGTCACGGTA

SBR TCGAGGAGAAAAGCGGCTGCTTTGTGACATACATCGGCGAAAGGTGACGCCGACGGTGGCGGCCACCGCCGCGGTCACGGTA

Jarissa TCGAGGAGAAAAGCGGCTGCTTTGTGACATACATCGGCGAAAGGTGACGCCGACGGTGGCGGCCACCGCCGCGGTCACGGTA

**********************************************************************************

Nias GCTGCGGCTGCCGCGATTCCGGTAGCGCTGCCGGTGGCGAAGCGACAGGGCTCGCCGGTGCTTTCCGGCGATGAGCAGGTGC

Dewata GCTGCGGCTGCCGCGATTCCGGTAGCGCTGCCGGTGGCGAAGCGACAGGGCTCGCCGGTGCTTTCCGGCGATGAGCAGGTGC

Guri 5 Agr GCTGCGGCTGCCGCGATTCCGGTAGCGCTGCCGGTGGCGAAGCGACAGGGCTCGCCGGTGCTTTCCGGCGATGAGCAGGTGC Guri 3 Agr GCTGCGGCTGCCGCGATTCCGGTAGCGCTGCCGGTGGCGAAGCGACAGGGCTCGCCGGTGCTTTCCGGCGATGAGCAGGTGC

SBR GCTGCGGCTGCCGCGATTCCGGTAGCGCTGCCGGTGGCGAAGCGACAGGGCTCGCCGGTGCTTTCCGGCGATGAGCAGGTGC

Jarissa GCTGCGGCTGCCGCGATTCCGGTAGCGCTGCCGGTGGCGAAGCGACAGGGCTCGCCGGTGCTTTCCGGCGATGAGCAGGTGC

**********************************************************************************

Nias TGTCGTCGAGCTCGTCCCCTGAGCCCCCCTTTCTAAATCAGTACGCGCCGTCCTACTCCGGCTCGGGCGGCGTTGCCTCCGG

Dewata TGTCGTCGAGCTCGTCCCCTGAGCCCCCCTTTCTAAATCAGTACGCGCCGTCCTACTCCGGCTCGGGCGGCGTTGCCTCCGG

Guri 5 Agr TGTCGTCGAGCTCGTCCCCTGAGCCCCCCTTTCTAAATCAGTACGCGCCGTCCTACTCCGGCTCGGGCGGCGTTGCCTCCGG Guri 3 Agr TGTCGTCGAGCTCGTCCCCTGAGCCCCCCTTTCTAAATCAGTACGCGCCGTCCTACTCCGGCTCGGGCGGCGTTGCCTCCGG

SBR TGTCGTCGAGCTCGTCCCCTGAGCCCCCCTTTCTAAATCAGTACGCGCCGTCCTACTCCGGCTCGGGCGGCGTTGCCTCCGG

Jarissa TGTCGTCGAGCTCGTCCCCTGAGCCCCCCTTTCTAAATCAGTACGCGCCGTCCTACTCCGGCTCGGGCGGCGTTGCCTCCGG

**********************************************************************************

Nias CGATCTCGGGGAAGAGAACGAGCGGCTGCGGCGGGAGAACTCGCGGCTGACGCGGGAACTCGGGCAGATGAAGAAGCTCTGC

Dewata CGATCTCGGGGAAGAGAACGAGCGGCTGCGGCGGGAGAACTCGCGGCTGACGCGGGAGCTCGGGCAGATGAAGAAGCTCTGC

Guri 5 Agr CGATCTCGGGGAAGAGAACGAGCGGCTGCGGCGGGAGAACTCGCGGCTGACGCGGGAGCTCGGGCAGATGAAGAAGCTCTGC Guri 3 Agr CGATCTCGGGGAAGAGAACGAGCGGCTGCGGCGGGAGAACTCGCGGCTGACGCGGGAGCTCGGGCAGATGAAGAAGCTCTGC

SBR CGATCTCGGGGAAGAGAACGAGCGGCTGCGGCGGGAGAACTCGCGGCTGACGCGGGAGCTCGGGCAGATGAAGAAGCTCTGC

Jarissa CGATCTCGGGGAAGAGAACGAGCGGCTGCGGCGGGAGAACTCGCGGCTGACGCGGGAGCTCGGGCAGATGAAGAAGCTCTGC

*********************************************************.************************

Nias AATAACATTTTCGTCCTCATGTCCAAGTACACCGACGGCCAGCAGACCGACGCCGCCAACGCGACCTCCGCCGCCGCCGACG

Dewata AATAACATTTTCGTCCTCATGTCCAAGTACACCGACGGCCAGCAGACCGACGCCGCCAACGCGACCTCCGCCGCCGCCGACG

Guri 5 Agr AATAACATTTTCGTCCTCATGTCCAAGTACACCGACGGCCAGCAGACCGACGCCGCCAACGCGACCTCCGCCGCCGCCGACG Guri 3 Agr AATAACATTTTCGTCCTCATGTCCAAGTACACCGACGGCCAGCAGACCGACGCCGCCAACGCGACCTCCGCCGCCGCCGACG

SBR AATAACATTTTCGTCCTCATGTCCAAGTACACCGACGGCCAGCAGACCGACGCCGCCGACGCGAGCTCCGCCGCTGCTGACG

Jarissa AATAACATTTTCGTCCTCATGTCCAAGTACACCGACGGCCAGCAGACGGACACCGCCAACGAGACCTCCGCCGCCGCCGACG

***********************************************.***.*****.****************.**.****

Nias TCGGGAATTGCTCTGGTGAGTCGGCAGAGACCACGGCGCTCCCACCTCCGCCGGTGCTCGAGCTCTTGCCTTCCTGCCAAAA

Dewata TCGGGAATTGCTCTGGTGAGTCGGCAGAGACCACGGCGCTCCCACCTCCGCCGGTGCTCGAGCTCTTGCCTTCCTGCCCAAA

Guri 5 Agr TCGGGAATTGCTCTGGTGAGTCGGCAGAGACCACGGCGCTCCCACCTCCGCCGGGGCTCGAGTTCATGCCTTCCGGCCCAAA Guri 3 Agr TCGGGAATTGCTCTGGTGAGTCGGCAGAGACCACGGCGCTCCCACCTCCGCCGGTGCTCGAGCTCTTGCCTTCCTGCCAAAA

SBR TCGGGAATAGCTCTGGTGAGTCGGCAGAGACCACGGCGCTCCCACCTCCGCCGGTGCTCGAGCTCTTGCCTTCCTGCCCAAA

Jarissa TCGGGAATTGCTCTGGTGAGTCGGCAGAGACCACGGCGCTCCCACCTCCGCCGGTGCTCGAGCTCTTGCCTTCCTGCCCAAA

********.*********************************************.**********.********.***.***

Nias TGCTCCCACGGCTGCCGATTTGGGCGCGGAGGACGAGGAGGAGAAGATGAGCGCTAGGCTCTTCGGCGTCTGCATCGGGCGG

Dewata TGCTCCCACGGCTGCCGATTTGGGCGCGGAGGACGAGGAGGAGAAGATGAGCGCTAGGCTCTTCGGCGTCTGCATCGGGCGG

Guri 5 Agr TGCTCCCACGGCTGCCGATTTGGGCGCGGAGGACGAGGAGGAGAAGATGAGCGCTAGGCTCTTCGGCGTCTGCATCGGGCGG Guri 3 Agr TGCTCCCACGGCTGCCGATTTGGGCGCGGAGGACGAGGAGGAGAAGATGAGCGCTAGGCTCTTCGGCGTCTGCATCGGGCGG

SBR TGCTCCCACGGCTGCCGATTTGGGCGCGGAGGACGAGGAGGAGAAGATGAGCGCTAGGCTCTTCGGCGTCTGCATCGGGCGG

Jarissa TGCTCCCACGGCTGCCGATTTGGGCGCGGAGGACGAGGAGGAGAAGATGAGCGCTAGGCTCTTCGGCGTCTGCATCGGGCGG

**********************************************************************************

Nias AAGCGAATGCGCCACGACGGCGAGGACCGGACGAGGCGAGGAGCGGCGGCGGAGGTGAAGCCTGAGCCGATGGACGCGCAGC

Dewata AAGCGAATGCGCCACGACGGCGAGGACCGGACGAGGCGAGGAGCGGCGGCGGAGGTGAAGCCTGAGCCGATGGACGCGCAGC

Guri 5 Agr AAGCGAATGCGCCACGACGGCGAGGACCGGACGAGGCGAGGAGCGGCGGCGGAGGTGAAGCCTGAGCCGATGAACGCGCAGC Guri 3 Agr AAGCGAATGCGCCACGACGGCGAGGACCGGACGAGGCGAGGAGCGGCGGCGGAGGTGAAGCCTGAGCCGATGGACGCGCAGC

SBR AAGCGAATGCGCCACGACGGCGAGGACCGGACGAGGCGAGGAGCGGCGGCGGAGGTGAAGCCTGAGCCGATGAACGCGCAGC

Jarissa AAGCGAATGCGCCACGACGGCGAGGACCGGACGAGGCGAGGAGCGGCGGCGGAGGTGAAGCCTGAGCCGATGAACGCGCAGC

79 Guri 3 Agritan Nias Dewata Guri 5 Agritan SBR Jarissa 45 94 58 0 2 4 6 8 10 12 Nias AGCCCTCCGGAATGGACGGTCACACACCGGACGTGCAAGCCTGGCCCATTTACAGGCCCAGACCCGTGTACCAACCCCTCCG Dewata AGCCCTCCGGAATGGACGGTCACACACCGGACGTGCAAGCCTGGCCCATTTACAGGCCCAGACCCGTGTACCAACCCCTCCG

Guri 5 Agr AGCCCTCCGGAATGG-CGGTCACACACCGGACGTGCAAGCCTGGCCCATTTACAGGCCCAGACCCGTGTACCAACCCCTCCG Guri 3 Agr AGCCCTCCGGAATGGACGGTCACACACCGGACGTGCAAGCCTGGCCCATTTACAGGCCCAGACCCGTGTACCAACCCCTCCG

SBR AGCCCTCCGGAATGG-CGGTCACACACCGGACGTGCA-GCCTGGCCCATTTACAGGCCCAGACCCGTGTACCAACCCCTCCG

Jarissa AGCCCTCCGGAATGG-CGGTCACACACCGGACGTGCAAGCCTGGCCCATTTACAGGCCCAGACCCGTGTACCAACCCCTCCG

***************.*********************.********************************************

Nias CGCCTCCGACGGGTCAAACTGCTACAGCGGGAGTGACGACCACAACGGGTCCAACTCCAGGTGAGCTCAGCTCAAAAAAGAA

Dewata CGCCTCCGACGGGTCAAACTGCTACAGCGGGAGTGACGACCACAACGGGTCCAACTCCAGGTGAGCTCAGCTCAAAAAAGAA

Guri 5 Agrr CGCCTCCGACGGGTCAAACTGCTACAGCGGGAGTGACGACCACAACGGGTCCAACTCCAGGTGAGCTCAGCTCAAAAAA--- Guri 3 Agr CGCCTCCGACGGGTCAAACTGCTACAGCGGGAGTGACGACCACAACGGGTCCAACTCCAGGTGAGCTCAGCTCAAAAAAAGA

SBR CGCCTCCGACGGGTCAAACTGCTACAGCGGGAGTGACGACCACAACGGGTCCAACTCCAGG-GAGCTC---

Jarissa CGCCTCCGACGGGTCAAACTGCTACAGCGGGAGTGACGACCACAACGGGTCCAACTCCAGGTGAGCTCAGCTCAAAAAAG--

*************************************************************.******...

Nias TAAGATACGATACCACCAGGTGAGCTGGGTTCAGGC

Dewata TAAGATCAGATCACTCCAGGTGAGCTGGGTTCAGGC

Guri 5 Agr ---CCAGGTGAGCTGGGTTCAGGC Guri 3 Agr T---CCAGGTGAGCTGGGTTCAGGC

SBR ---CCAGGTGAGCTGGGTTCAGGC

Jarissa ---CCAGGTGAGCTGGGTTCAGGC

...

Gambar 5.11 Pensejajaran basa nukleotida pada enam genotipe gandum. Garis bawah menunjukkan posisi primer, berturut-turut : forward primer, inner primer, dan reverse primer. Intron ditandai dengan huruf kecil. Nukleotida dalam kotak menunjukkan posisi start codon dan stop codon.

Analisis terhadap hubungan kekerabatan berdasarkan sekuen nukleotida gandum didapatkan informasi bahwa Guri 3 Agritan, Nias, dan Dewata mengelompok dalam satu percabangan (Gambar 5.12). Pengelompokan tersebut juga diperoleh hampir sama seperti pada pengelompokan berdasarkan karakter morfologi, dimana genotipe yang lebih awal diintroduksi berada pada satu klaster terpisah dengan sebagian besar genotipe yang baru diintroduksi. Guri 3 Agritan yang merupakan genotipe yang baru diintroduksi yang diintroduksi pada tahun 2014 ternyata memiliki kesamaan nukleotida dengan genotipe Nias dan Dewata yang merupakan genotipe yang lebih awal diintroduksi, sehingga persilangan Guri 3 Agritan dengan genotipe yang lebih awal diintroduksi sebaiknya tidak dilakukan.

Gambar 5.12 Dendrogram hasil analisis filogenetik enam genotipe gandum berdasarkan sekuen nukleotida gen TaHSF-2 menggunakan metode UPGMA

Jarissa memiliki jarak genetik yang paling jauh, ditunjukkan dengan panjang cabang yang panjang. Semakin panjang cabangnya semakin besar perbedaan rataan substitusi basa nukleotida per situs. Angka pada sumbu Genotipe yang lebih awal diintroduksi Genotipe yang baru diintroduksi

percabangan merupakan nilai bootstrap (1000 ulangan), mengindikasikan konsistensi re-sampling dalam ulangan. Semakin besar nilainya, semakin diyakini bahwa hipotesis genotipe-genotipe tersebut berdekatan adalah benar. Genotipe Jarissa dapat disilangkan dengan genotipe Nias, Dewata, maupun Guri 3 Agritan berdasarkan perbedaan susunan nukleotida gen TaHSF-2 yang cukup jauh.

Beberapa situs SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ditemukan pada gen TaHSF-2 dari genotipe yang digunakan (Tabel 5.7). SNP merupakan variasi substitusi satu pasang basa yang terjadi pada posisi tertentu dalam gen atau genom. SNP dijadikan sebagai basis pengembangan marka molekuler SNAP (Single Nucleotide-Amplified Polymorphism).

Tabel 5.7 Karakter SNP yang diidentifikasi pada gen TaHSF-2 pada enam genotipe gandum

SNP Posisi SNP Substitusi basa Mayoritas alel Minoritas alel

1 981 [A/C] C A

2 1139 [A/G] G A

3 1164 Indel Insersi Delesi

Berdasarkan Tabel 5.7, ketiga situs SNP yang ditemukan berpotensi dikembangkan sebagai marka molekuler SNAP. Selain itu, perbedaan susunan

Dalam dokumen Analisis Keragaman Genetik Pada Gandum (Triticum Aestivum L) Hasil Introduksi Menggunakan Karakterisasi Morfologi Dan Molekuler (Halaman 87-106)