Pembuatan dan evaluasi kultur starter meliputi tahap persiapan kultur starter, penentuan waktu pemanenan BAL dan probiotik, pengeringan BAL, pengeringan sinbiotik, penentuan formulasi, pembuatan granul, evaluasi fisik granul dan pengemasan.
Persiapan Kultur Starter Yogurt dan Probiotik
Persiapan kultur starter meliputi pemeriksaan kultur starter melalui pemeriksaan mikroskopik dengan bantuan metode pewarnaan Gram dan uji katalase (Fardiaz, 1989).
Pengujian morfologi St RM-01, Lb RM-01, La RM-01 dan Bf RM-01 menggunakan metode pewarnaan Gram dilakukan dengan cara menyiapkan preparat bakteri pada gelas objek yang telah difiksasi dan ditetesi dengan berbagai larutan secara berurutan, yaitu kristal violet, larutan iodin, alkohol 95% (bahan pemucat), dan safranin. Bakteri yang telah diwarnai dicuci dari sisa pewarna dan dikeringkan, kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100x. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram positif yang mempertahankan zat pewarna kristal violet. Kelompok yang lain yaitu bakteri Gram negatif yang akan kehilangan warna kristal violet bila dicuci dengan alkohol 95 %, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin akan tampak berwarna merah.
Pengujian katalase dilakukan dengan cara preparat bakteri yang telah dioleskan pada gelas objek ditetesi dengan satu tetes H2O2, apabila penetesan H2O2 menimbulkan gelembung, maka bakteri yang diperiksa termasuk kelompok bakteri katalase positif, sebaliknya apabila tidak menghasilkan gelembung gas maka termasuk kelompok bakteri katalase negatif.
Penentuan Waktu Pemanenan Sel-sel Bakteri Asam Laktat sebagai Kultur Starter Yogurt dan Probiotik (Tamime, 2005)
Syarat kultur bakteri yang digunakan sebagai kultur starter adalah memiliki viabilitas tinggi dengan jumlah minimal 107-109 cfu/g. Maka perlu diketahui lama inkubasi yang diperlukan untuk mendapatkan kondisi kultur yang optimal dan jumlah sesuai untuk digunakan sebagai starter. Kultur starter kerja bakteri asam laktat harus dikondisikan pada fase logaritmik ketika sel-sel bakteri dipanen untuk menghindari fase log atau adaptasi yang terlalu lama sebelum aktif memfermentasikan susu.
Bakteri dipanen pada waktu sesuai kurva pertumbuhan. Kultur kerja bakteri asam laktat sebanyak 5% (v/v) diinokulasikan ke dalam media MRS broth (250 ml) lalu diinkubasikan pada suhu 37± 10C dan pertumbuhannya diikuti selama 24 jam. Pengamatan dilakukan setiap 1 jam diukur nilai Optical Density untuk kemudian dikorelasikan jumlah populasi bakteri berdasarkan kurva standar yang telah disiapkan sebelumnya, sesuai Prescott et al., (2003).
Pembuatan Kultur Starter Kering Yogurt
Pembuatan kultur starter kering yogurt diawali dengan inokulasi masing- masing kultur starter yogurt sebanyak 5% (v/v) ke dalam susu skim cair untuk menghasilkan kultur kerja. Inkubasi dilakukan untuk masing-masing isolat pada suhu 37± 10C sesuai waktu pada kurva pertumbuhan, yaitu untuk mencapai jumlah bakteri yang dapat digunakan sebagai kultur starter. Selanjutnya kultur kerja yang diperoleh ditambah dengan maltodekstrin 4% sebagai pengisi dan laktosa 6% sebagai senyawa kriogenik (Hartaji, 2000; Pratiwi, 2005). Semua bahan dicampur dan diaduk hingga homogen, selanjutnya dilakukan proses pengeringan untuk menghasilkan bubuk kultur starter yogurt dengan metode spray dry yang bertekanan 154 cmHg, suhu inlet 180 oC dan suhu outlet 80 oC (Robinson et al., 1981). Diagram alir pembuatan kultur starter kering yogurt dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Diagram Alir Pembuatan Bubuk Kultur Starter Yogurt Kering
Pembuatan Sinbiotik Terenkapsulasi dalam Bentuk Kering (Reyed, 2007 yang dimodifikasi)
La RM-01 dan Bl RM-01 ditumbuhkan secara terpisah, masing-masing sebanyak 5% (v/v) dalam media deMan’s Rogosa Sharpe Broth (MRSB) pada suhu 37±10C dan dipanen pada fase logaritmik sesuai waktu pada kurva pertumbuhan. Sel bakteri dipanen dengan sentrifugasi dingin (4oC) selama 20 menit pada 10.000 rpm. Sel bakteri yang diperoleh dilarutkan pada 100 ml larutan 10% (b/v) susu skim, 5% (v/v) gliserol dan 0,1% (b/v) CaCO3 dan penambahan 2% (b/v) inulin, selanjutnya diperangkap selama 45 menit di dalam 100 ml larutan alginat steril dengan konsentrasi 3% (b/v). Campuran tersebut disemprotkan pada larutan kalsium klorida (0,1M) dengan menggunakan alat tetes (spoid). Setelah satu jam, gel yang terbentuk dipindahkan ke dalam larutan fisiologis (0,85%) untuk mendapatkan struktur gel yang kompak, selanjutnya dipindahkan ke air distalasi dan diputar secara perlahan selama 1 jam untuk menghilangkan residu CaCl2. Butiran-butiran sinbiotik terenkapsulasi yang telah diperangkap di kalsium klorida siap untuk dikeringkan. Pengeringan biokapsul dilakukan dengan menggunakan metode freeze dry. Sebelumnya biokapsul dibekukan di freezer (suhu -20oC selama 24 jam). Tabung berisi sinbiotik terenkapsulasi dihubungkan dengan vacuum chamber. Proses
Susu Skim Cair + 5% (v/v) St RM-01 atau Lb RM-01
Bubuk St RM-01 atau Lb RM-01 St RM-01 + 6% (b/v) laktosa + 4%
(b/v) Maltodekstrin
Spray Dry Inlet 1800C; outlet 800C Inkubasi suhu 370C selama 10 jam
pengeringan beku berlangsung stabil pada suhu -55oC dengan tekanan 1 mbar selama 24 jam. Diagram alir biokapsulasi sinbiotik dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Diagram Alir Biokapsulasi Sinbiotik (Reyed, 2007 yang dimodifikasi)
InokulasiLa RM-01 5% (v/v) atau Bl RM-01 5% (v/v) pada MRSB pH 7
Inkubasi pada suhu 370C selama 16 jam Sentifugasi (40C) selama 20 menit pada 10.000 rpm
Pelarutan sel bakteri dalam media enkapsulasi larutan : 100 ml aquades + 10% susu skim+5%
gliserol + (prebiotik) inulin 2% + 0,1%CaCO3
Campuran diperangkap (45 menit) dalam larutan alginat steril (3% b/v)
Campuran diteteskan pada CaCl2 0,1 M dibiarkan selama 1 jam
Penguatan struktur gel yang dalam larutan fisiologis (0,85%)
Pencucaian gel yang terbentuk dipindahkan ke air distilasi
Enkapsulasi sinbiotik siap untuk dikeringkan (Freeze drying)
Penentuan Formulasi
Penentuan formulasi granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi terdiri dari 3 formulasi yaitu L21S1, L20S2, L19S3. Formulasi kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dalam bentuk granul dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Formulasi Granul Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi
Bahan Granul Formulasi
L21S1 L20S2 L19S3
---% (b/b) --- Kultur Starter Yogurt
Bubuk St RM-01 25 25 25
Bubuk Lb RM-01 25 25 25
Bioenkapsul Probiotik Kering
La RM-01 1 1 1
Bl RM-01 1 1 1
Laktosa 21 20 19
Susu Skim 26 26 26
Sodium Starch Glikolat (SSG)
1 2 3
Total 100 100 100
Pembuatan Granul Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi (Gusti et al., 2005)
Pembuatan granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi melalui metode granulasi basah. Tahapan proses granulasi basah meliputi pengecilan ukuran partikel bahan utama dan bahan tambahan, pencampuran bahan-bahan, pembuatan massa granul dengan cara menambahkan sukrosa sebagai larutan pengikat, pengayakan basah, pengeringan granul dengan oven pada suhu 400C selama 2 jam kemudian diayak kembali untuk memperoleh ukuran granul yang lebih kecil. Diagram alir proses pembuatan granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Proses Pembuatan Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi dalam Bentuk Granul dengan Metode Granulasi Basah
Evaluasi Granul Kultur Starter Yogurt dengan Sinbiotik Terenkapsulasi Kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dalam bentuk granul terlebih dahulu diuji kelayakan karakteristik fisiknya sebelum diolah lebih lanjut untuk diaplikasikan. Uji evaluasi granul meliputi waktu larut dan kompresibilitas.
Kompresibilitas (Wells, 1987)
Kompresibilitas dievaluasi menggunakan alat bulk density tester. Sebanyak 50 g granul dimasukkan dalam gelas ukur 100 ml, lalu diukur volumenya (V1). Berat jenis bulk = m/V1. Massa dalam gelas ukur diketuk-ketukkan sebanyak 300 kali, sampai volume tetap (V2). Berat jenis mampat = m/V2
Kompresibilitas (%) = 100% mampat jenis berat bulk jenis berat mampat jenis berat × − Penimbangan bahan baku granul Mixing I Shifting I Drying 400C, 2 jam Shifting II Granul Pengemasan Penambahan Biokapsul
Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan tabel kriteria indeks kompresibilitas (Tabel 3) sesuai dengan United State Pharmacopeia (2005).
Tabel 3. Kriteria Indeks Kompresibilitas
Indeks Kompresibilitas (%) Kategori laju alir
<10 Istimewa 10-15 Baik 16-20 Sedang 21-25 Cukup baik 26-31 Jelek 32-37 Sangat Jelek >38 Sangat-sangat jelek
Sumber: United State Pharmacopeia, 2005
Waktu Larut (Well, 1987)
Waktu larut diukur menggunakan alat erweka ZT3. Sebanyak 10 g sampel granul yang akan diukur waktu larutnya dimasukkan ke dalam tempat tabung. Wadah penampung diisi aquadest (370C) dengan volume penuh sehingga tempat tabung tercelup. Alat Erweka ZT3 dinyalakan dan waktu yang diperlukan seluruh granul larut dicatat. Kelarutan dinyatakan dalam menit. Granul akan larut sempurna jika reaksi telah selesai.
Proses Pengemasan (Buckle et al.,1987)
Bahan pengemas digunakan untuk membatasi bahan pangan dan keadaan normal sekeliling yang berfungsi sebagai penunda proses kerusakan. Granul kultur starter yogurt dengan sinbiotik terenkapsulasi dikemas secara vakum dan aseptik menggunakan alumunium foil berlapis Low Density Polyetylen (LDPE) dan tiap kemasan berisi 10 gram. Produk disimpan pada suhu refrigerator (5±10C).
Tahap II. Aplikasi Kultur Starter Kering Yogurt dengan Probiotik