3.3. Metode Penelitian
3.3.1. Pembuatan sediaan histologi
Seluruh organ yang di sampling di fiksasi di dalam buffer netral formalin (BNF) 10%, minimal selama 48 jam. Selanjutnya sampel di proses untuk membuat
sebanyak tiga kali. Proses berikutnya adalah infiltrasi parafin cair ke dalam jaringan. Proses pembuatan di lakukan dengan alat automatic tissue processor (Sakura)™. Pembuatan blok jaringan di lakukan dalam parafin pada tissue embedding console (Sakura)™. Blok jaringan di iris menggunakan mikrotom dengan ketebalan 3-5 µm. Hasil sayatan di lekatkan diatas gelas objek dan di inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37oC selama 1 malam dan siap di warnai. Untuk pewarnaan imunohistokimia (IHK), gelas objek terlebih dahulu di lapisi dengan gelatin 6 %.
3.3.2. Pewarnaan Hematoxyllin-Eosin, Masson Trichrome, Verhoeff Van Giesson dan Imunohistokimia
Pewarnaan Hematoxyllin Eosin (HE) di lakukan untuk mengamati perubahan jaringan secara umum, Masson Trichrome (MT) dan Verhoeff Van Giesson (VVG) di gunakan untuk mengamati perubahan struktur buluh darah. Hasil pewarnaan diinterpretasikan sebagai berikut: warna merah kekuningan atau kecoklatan pada Masson Trichrome (MT) menunjukkan struktur kolagen, sedangkan warna biru menunjukan struktur serabut elastik. Warna biru hitam pada Verhoeff Van Giesson (VVG) menunjukkan serabut elastik. Pewarnaan imunohistokimia di lakukan untuk mengetahui distribusi antigen hog cholera pada organ-organ sampel.
Sebelum pewarnaan, sayatan jaringan pada objek gelas di lakukan deparafinisasi dan rehidrasi (lampiran 1). Selanjutnya di warnai dengan HE metode Humason (1972) yang di modifikasi, Verhoeff Van Giesson dan Masson Trichrome modifikasi Goldner (Kiernan 1990). Pewarnaan imunohistokimia di lakukan berdasarkan metoda Avidin Biotin Complex (ABC method) (Hsu et al. 1981). Sebelum di lakukan proses pewarnaan, terlebih dahulu di lakukan proses preinkubasi terhadap jaringan, yang meliputi blocking endogenous peroxidase dengan larutan 0,3% H2O2 dalam metanol selama 30 menit untuk memblokir aktivitas peroksida endogen dan blocking background dengan 10% normal goat serum selama 30 menit (Vector Laboratories, Inc). Untuk un masking antigen di lakukan dengan cara pemanasan menggunakan microwave 100oC selama 5 menit. Selanjutnya di inkubasi menggunakan antibodi primer yaitu anti-HCV antibody monoclonal (WA303, Central Veterinary Laboratory, New Haw, Addlestone, UK) dengan pengenceran 1:500, diinkubasi di dalam refrigerator selama 24 jam. Antibodi sekunder, di gunakan Histofine code 424021 (Nichirei Corp.) selama 30 menit dalam inkubator 37oC. Sebagai marker di gunakan campuran 10 μl avidin dan 10 μl biotin (Vector Laboratories, Inc.) dalam 1 ml
PBS dan di inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37oC selama 30 menit. Untuk visualisasi hasil pewarnaan, jaringan di inkubasi dengan larutan 0.03% 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) selama 5-10 menit. Pada setiap langkah di atas, jaringan di bilas menggunakan larutan Phosphat buffer saline (PBS). Untuk pewarnaan latar belakang di gunakan pewarna Mayer Hematoxyllin selama 30 detik. Selanjutnya sampel di dehidrasi dan clearing, kemudian di tutup dengan gelas penutup menggunakan bahan perekat entelan.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Gejala Klinis
Gejala klinis yang di temukan di lapangan dari 10 ekor babi yang terserang penyakit hog cholera menunjukkan gejala: lemah atau kurang aktif, depresi (gambar 4), bergerombol di pojok kandang, diare kekuningan atau kecoklatan dan berbau. Umumnya babi mengalami konjungtivitis (gambar 5), muntah, demam dengan suhu badan mencapai 42°C, eritema pada ujung telinga (gambar 6), leher bagian bawah, abdomen dan siku-siku kaki (gambar 7). Kematian yang di sertai dengan pembesaran skrotum (gambar 8). Babi kontrol yang digunakan merupakan babi sehat tanpa di vaksinasi, tidak menunjukkan gejala klinis sakit (gambar 9). Data babi sampel dan kontrol yang di gunakan dalam penelitian dapat di lihat pada tabel 3 di bawah ini.
Tabel 3. Data Babi Sampel dan Kontrol Babi Sampel
Nomor
Umur Jenis Kelamin
Ras Lamanya Sakit
1. 2 bulan Jantan Sus scrofa domesticus 5 hari 2. 2 bulan Jantan Sus scrofa domesticus 7 hari 3. 4 bulan Jantan Sus scrofa domesticus 11 hari 4. 24 bulan Jantan Persilangan 35 hari 5. 6 bulan Betina Persilangan 31 hari 6. 2 bulan Jantan Sus scrofa domesticus 9 hari 7. 3 bulan Betina Sus scrofa domesticus 15 hari 8. 10 bulan Jantan Persilangan 31 hari 9. 7 bulan Jantan Sus scrofa domesticus 33 hari 10. 24 bulan Jantan Persilangan 38 hari Babi Kontrol
Nomor
1. 2 bulan Jantan Sus scrofa domesticus 2. 6 bulan Jantan Persilangan 3. 24 bulan Jantan Persilangan
Gambar 4. Babi lemah, kurang aktif dan depresi pada babi lokal kasus Sentani
Gambar 5. Konjungtivitis (tanda panah) pada babi lokal kasus Sentani
HC
Gambar 6. Eritema pada kulit bagian ujung telinga (tanda panah) kasus Sentani
Gambar 7. Eritema siku-siku kaki (tanda panah) kasus Sentani
HC
HC
Gambar 8. Kematian yang di sertai dengan pembesaran skrotum (tanda panah) kasus Sentani
Gambar 9. Babi sehat daerah Sentani
Pengamatan gejala klinis yang di temukan di lapangan pada kasus ini umumnya ternak babi memperlihatkan gejala berupa depresi, bergerombol, diare, muntah dan eritema pada kulit ujung telinga dan abdomen serta konjungtivitis. Gejala tersebut
HC
beberapa peneliti terdahulu yaitu Liess et al. (1992) dan Van Oirschot et al. (1999). Laporan mereka mengemukakan bahwa pada babi yang terinfeksi hog cholera seringkali memperlihatkan adanya tanda klinis berupa eritema pada kulit ujung telinga, konjungtivitis dan batuk. Infeksi buatan virus hog cholera isolat Quillota terhadap 35 ekor babi yang di lakukan oleh Quezada et al. (2000), menunjukkan gejala klinis antara lain: demam, nafsu makan menurun, konstipasi, diare, eritema pada kulit, konjungtivitis. Infeksi buatan virus hog cholera isolat Alfort 187 terhadap16 ekor babi umur 4 bulan telah di lakukan oleh Nunez et al. (2005), hasilnya di temukan gejala klinis berupa: nafsu makan menurun, gangguan saluran pencernaan dan eritema. Peneliti lain Narita et al. (1996) telah melakukan infeksi buatan virus hog cholera isolat The Kanagawa, yaitu strain virus hog cholera yang di isolasi dari kasus penyakit kronis. Hasil infeksi yang di lakukan terhadap 7 ekor anak babi umur 4 hari tersebut, di temukan gejala menurunnya nafsu makan yang berlangsung pada hari ke 7 hingga ke -11 pasca infeksi namun tidak ada kematian anak babi selama masa observasi.
Pembesaran skrotum pada kasus hog cholera di Jayapura yang di temukan pada babi nomor 4 umur 24 bulan dan babi nomor 8 umur 10 bulan, ini di duga merupakan bentuk infeksi pada testis atau orchitis. Kasus pembesaran skrotum belum pernah di laporkan pada penemuan sebelumnya, pada kasus penelitian ini tidak dilakukan sampling terhadap skrotum sehingga tidak dapat di bahas mengapa hal tersebut terjadi. Jika lesio pembesaran skrotum di kaitkan dengan temuan lesio pada organ lain maka diprediksikan terjadi hidrosel pada skrotum babi. Babi yang sudah menunjukkan gejala-gejala klinis seperti tersebut di atas 90% akan mengalami kematian. Tingginya tingkat viremia terjadi sebagai akibat dari perkembangan virus di dalam jaringan limfoid dan juga leukosit. Sementara pengamatan gejala klinis pada babi kontrol tidak menunjukkan adanya kelainan, hal ini di sebabkan karena babi yang di gunakan sebagai kontrol merupakan babi sehat.