BAB VI. HASIL DAN PEMBAHASAN
E. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak
Ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L) dibuat seri konsentrasi
untuk diujikan pada bakteri uji sebesar 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,90% dan 100%. Pembuatan seri konsentrasi ekstrak dengan cara
melarutkan sejumlah ekstrak etanol biji pinang (Areca catechu L.) ke dalam
DMSO sampai 2 ml. Komposisi pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol biji pinang dapat dilihat dalam Tabel II.
Kultur bakteri bentuk
bulat Gram positif
Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
Digunakan sebagai stok Kultur bakteri bentuk
batang Gram positif
Kultur bakteri bentuk
batang Gram negatif
distreakpada mediaagar miring
TSA
Masing-masing kulturdistreak
commit to user
Tabel II. Komposisi pembuatan seri konsentrasi ekstrak etanol biji pinang
Konsentrasi (%) Ekstrak (gram) DMSO (mL) 0 0 ad 2 10 0,2 ad 2 20 0,4 ad 2 30 0,6 ad 2 40 0,8 ad 2 50 1,0 ad 2 60 1,2 ad 2 70 1,4 ad 2 80 1,6 ad 2 90 1,8 ad 2 100 2,0 ad 2
f. Pembuatan larutan kontrol
Kontrol yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri ini terdiri dari kontrol DMSO dan kontrol klindamisin 0,0075 %.
g. Pengujian aktivitas antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi padat
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
31
E. Analisis Data
Analisis data dilakukan secara deskriptifmelalui pengamatan morfologi koloni (bentuk dan warna), sifat Gram bakteri pada jerawat dan diameter daya hambat ekstrak terhadap pertumbuhan bakteri uji.
Media MHA disterilkan
Media MHA dengan suhu 40-55º C Bakteri uji dipindahkan
Bakteri dan media MHA dihomogenkan
Dituang ke cawan petri sebanyak 15 mL
Dibiarkan memadat
Dibuat lubang sumuran pada media uji
Dimasukkan larutan seri konsentrasi ekstrak, kontrol DMSO, dan kontrol klindamisin 0,0075% dalam lubang masing-masing 20 µL.
Dibandingkan hasil pada sampel uji dengan kontrol DMSO dan klindamisin 0,0075%
Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam
Diukur diameter zona hambat
Replikasi 2 kali
Dibandingkan nilai diameter zona hambat antar bakteri uji
commit to user
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Identifikasi Sampel
Identifikasi biji pinang yang diperoleh dari Pasar Gedhe dan Pasar Legi Surakarta dilakukan di Lembaga Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat (LPPM) Universitas Setia Budi Surakarta dengan menggunakan buku acuan
“Flora”. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa jenis tanaman yang diteliti
merupakan Areca catechu L. dengan nama umum pinang. Hasil determinasi dapat
dilihat pada Lampiran 1.
B. Preparasi dan Ekstraksi Sampel
Biji pinang sebanyak 1,5 kg yang telah dipisahkan dari sabut dan daging buah dicuci kemudian diiris melintang. Proses pengeringan dilakukan dibawah sinar matahari dengan cara menutup sampel dengan kain hitam untuk mencegah paparan sinar UV yang dapat merusak kandungan senyawa aktif (Anonim, 1986), sesekali sampel dibalik supaya kering disetiap sisi. Tujuan dilakukan proses
pengeringan untuk mengurangi kadar air yang terkandung dalam
simplisiasehingga dapat meminimalkan pertumbuhan jamur selama penyimpanan dan menghentikan reaksi enzimatik untuk mencegah kerusakan simplisia.
Simplisia biji pinang kemudian diserbuk dan diayak, dengan memperkecil ukuran akan memperluas bidang permukaan yang berinteraksi dengan pelarut sehingga senyawa aktif akan mudah untuk tersari (Anonim, 1986). Serbuk yang diperoleh dari 1,5 kg biji pinang basah sebanyak 700 gram. Sampel yang berbentuk serbuk kemudian diekstraksi dengan metode maserasi dengan pelarut
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
33
etanol 70%.Pemilihan etanol 70% sebagai larutan penyari mengacupadapenelitian Puspawati (2010) yang menyatakanbahwaekstrak etanol 70% biji pinang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus dan
Pseudomonas aeruginosa, selain itu etanol juga merupakan pelarut inert, tidak toksik, mudah diperoleh, dan harga terjangkau. Etanol 70% bersifat polar sehingga dapat digunakanuntuk menyari senyawa polar yang terkandung dalam biji pinang.
Selama proses maserasi dilakukan pengadukan 3-5 kali sehari, fungsi pengadukan adalahuntuk membantu kontak pelarut pada rongga sel tumbuhan, sehingga senyawa tumbuhan yang terkandung di dalamnya dapat tertarik keluar, selain itu pengadukan juga dapat menimbulkan sirkulasi pelarut sehingga ekstraksi dapat berlangsung optimal. Adanya perbedaan konsentrasi antara cairan di dalam dan di luar sel akan menyebabkan senyawa aktif terdesak ke luar sel yang memiliki konsentrasi yang lebih rendah. Proses ekstraksi akan terus berlanjut hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara cairan di dalam dan di luar sel sehingga cairan menjadi jenuh dan proses ektraksi terhenti (Ristiningsih, 2009).
Maserat yang diperoleh kemudian disaring menggunakan kain flanel.
Filtrat kemudian dipisahkan dengan pelarutnya menggunakan rotary evaporator
dengan suhu 55o C dengan kecepatan putar 5rpm, selanjutnya dipekatkan dengan
menggunakan waterbath dengan suhu 55oC hingga dihasilkan ekstrak kental
berwarna coklat kemerahan.Ekstrak kental yang diperoleh sebanyak 68,871 gram dengan rendeman 9,839%, perhitungan rendemen terlampir padaLampiran2.
commit to user
C. Pengambilan Apusan Darah Jerawat
Pada penelitian ini, digunakan seorang probandus yang memiliki jerawat untuk diambil apusan darah jerawat.Apusan darah jerawat diambil dari 4 jerawat
probandus yang dilakukan secara aseptiskemudianditanampadamedia Nutrient
Agar(NA) dengan metode streak.Akuades steril digunakan untuk membentuk
suspensi darah sehingga mempermudah darah untuk diapuskan pada media.
Metode streakatau cawan gores digunakanuntukmendapatkan koloni yang terpisah
sehingga mempermudah proses isolasi.Biakan kemudian diinkubasi pada suhu
37oC selama 24 jam.Pada permulaan goresan akan terjadi pertumbuhan koloni
yang lebat, sehingga harus dilakukan pemisahan koloni yang terbentuk. Gambar koloni apusan darah jerawat dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Koloni apusan darah jerawat (A). Jerawat 1, (B).Jerawat 2 , (C). Jerawat 3, dan (D). Jerawat 4
A B
C
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
35
D. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji
Pemisahan koloni dilakukan untuk mendapatkan isolat bakteridengandasar pemilihan padabentukdanwarnakoloninya.Proses pemisahan / isolasi tahap I ini dilakukan terhadap biakan bakteri apusan darah jerawat.Biakan bakteri apusan darah jerawat inidiambil 10 koloni yang terpisah.
Selanjutnyamasing-masingkoloniinidibiakkanpadamedia NA dengan
metodestreakdandiinkubasiselama 24 jam pada suhu 37oC .Sebelum dilakukan
pengecatan Gram, masing-masing koloni bakteri yang akan diuji dipindahkan
menggunakan metode streak pada media miring NA dalam 10 tabung reaksi
sehingga mempermudah pengambilan, penyimpanan dan mengurangi resiko kontaminasi. Gambar stok koloni apusan darah jerawatpada agar miring NA dalam tabung reaksi terdapat pada Gambar 10.
Gambar 10. Stok koloni apusan darah jerawat dalam tabung reaksi
Langkah selanjutnya adalah pengecatan Gram untuk mengidentifikasi sifat Gram bakteri yang diuji. Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri Gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan
commit to user
tidak terwarnai safranin. Bakteri Gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin. Menurut Gozali (2009) hasil pengecatan Gram yang tidak sama ini disebabkan oleh perbedaan susunan dinding sel dari bakteri seperti terlihat pada Gambar 3. Bakteri Gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipopolisakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri Gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru.
Dari hasil pengecatan Gram yang dilakukan terhadap10 kolonibakteri uji diperolehhasil 9 kolonimerupakanbakteribentukbulat Gram positifdan 1 kolonimerupakancampurandaribakteribentukbatang Gram negatif danpositif (Tabel III). Sedangkan hasilpemisahan koloni dan pengecatanGram kolonitabung 1 sampai 10dapatdilihatpadaGambar 11.
Tabel III. Hasil pengecatan Gram koloni bakteri apusan darah jerawat
No. Tabung Bentuk Bakteri Sifat Gram
1. Bulat Positif 2. Bulat Positif 3. Bulat Positif 4. Bulat Positif 5. Bulat Positif 6. Bulat Positif 7. Bulat Positif 8. Bulat Positif 9. Bulat Positif 10. Batang Batang Positif Negatif
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
37
A.
B.
Gambar 11.Pemisahan koloni tahap satu dalam media NA : (A) Hasil pengecatan Gram dan kultur koloni bakteri bentuk bulat Gram positif tabung 1-9, (B) Hasil pengecatan
Gram dan kultur koloni bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif (campuran) tabung 10.
Dari hasil pemisahan koloni tahap 1 ini ditemukan koloni bakteri bentuk bulat Gram positif dan koloni campuran antara bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif. Dengan demikian perlu dilakukan pemisahantahap 2 untuk mendapatkan koloni bakteri bentuk batang Gram positif dan Gram negatif.Pemisahan bakteri bentukbatangGram positif dan negatif dilakukan
dengan menggunakandua media yaitumedia Agar Darah dan MacConkey.Media
Agar Darah merupakan media diperkaya yang dapat menyediakan nutrisi ekstra untuk pertumbuhan bakteri.Media Agar Darah termasuk dalam media differensial yaitu media yang dapat membedakan bakteri yang memiliki kemampuan untuk
hemolisis dan tidak. Menurut Kamel et al.,(2011)daribakteribentukbatangGram
commit to user
terdapatpadakasusinfeksikulit pada luka bakar. SedangkanMedia MacConkey
merupakan media selektif untuk bakteri batang Gram negatif. Media inimengandunggaram empedu dan kristal ungu yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri batangGram positif sehingga koloni bakteri yang tumbuh pada media ini adalah batang Gram negatif.Pertumbuhan koloni tabung 10 pada
media Agar Darah dan MacConkey terdapat pada Gambar 12.
A. B.
Gambar 12. Pertumbuhan koloni tabung 10 pada (A) Agar Darah (B) MacConkey Agar
Dari hasildapatdilihatbentukkolonibakteri bentuk
batangpadaMacConkeyadalahtidak bersifat hemolisis, sedangkan pada Agar Darah
dapat dilihat perbedaan pertumbuhan bakteri batang Gram positif dan negatif yang memiliki sifat tidak menghemolisis Agar Darah, darihasilpertumbuhanpada media dapatdilihatada 2 koloni yang berbedauntukkolonibakteri gram negatifdanpositif.
Denganmetodediatasmakadapatdipisahkan 2 jenisbakteribatangGram
positifdannegatif.Untukmemperkuathasil dan memastikan sifat Gramnya maka dilakukanpengecatanGram daribakteri yang didapat.Dari hasil pengecatan Gram diperoleh hasil bakteri bentuk batang Gram positifdannegatif.Sepertitampakpada Gambar 13.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
39
A. B
Gambar 13.Hasil pengecatan Gram dari pemisahan tabung nomor 10: (A) Bakteri bentuk batang Gram positif, (B) Bakteri bentuk batang Gram negatif
Dari proses pemisahandanpengecatan Gram inidapatdihasilkantiga isolat
bakteridariapusandarahjerawatyaitubakteri bentukbulatGram positif, bentuk
batangGram positifdanGram negatif.
Ketigaisolat bakteri uji yang diperoleh kemudian diregenerasi 3-5 kali untuk mendapatkan biakan bakteri dengan fase pertumbuhan yang optimalselanjutnya dibuat stok.Stok bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif dibuat pada media NA karena media NA mengandung nutrisi yang lengkap untuk pertumbuhan bakteri. Stok bakteri bentuk bulatGram positif dibuat dalam media
agar miring TSA yaitu Tryptone Soya Agar karena pada media TSA bakteri
tumbuh lebih subur daripada menggunakan media NA (Gentry et al., 2000). Cara
pembuatan stok bakteri yaitu dengan mengambil koloni bakteri dengan ose kemudian digoreskan pada media NA miring atau TSA miring kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oCdandisimpandalamlemari pendingin.
Stok bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 14.Stok bakteri dibuat pada media miring dengan tujuan untuk memperoleh luas permukaan yang lebih besar sehingga diharapkan koloni yang tumbuh lebih banyak selain itu dapat memudahkan dalam pengambilan bakteri untuk pengujian.Penyimpanan stok bakteri pada suhu rendah dapat mengurangi laju metabolisme dengan tetap
commit to user
mempertahankan viabilitas (daya hidupnya) ciri-ciri genetiknya tetap stabil (tidak terjadi perubahan fisik) (Soni, 2010). Stok bakteri juga perlu dilakukan regenerasi untuk mencegah bakteri mati selama penyimpanan karena kurangnya nutrisi.
A B C
Gambar 14.Stok bakteri bentuk: (A) Bulat Gram positif, (B) BatangGram positif, dan (C) Batang Gram negatif pada media agar miring
Identifikasi bakteri uji dapatdilakukandengan 2
carayaitumelaluipengamatanbentuk danwarnakoloninya
sertapengamatanmorfologinya.
Pengamatanbentukdanwarnakolonidapatdilakukansecaralangsung di media
pertumbuhan.Pengamatan morfologi bakteri dilakukan
dibawahmikroskopdilengkapidenganpengecatanGram.Denganmetodeiniakandiper oleh data tentangbentuk, susunan seldansifatGramnya. Pengamatandibawah mikroskop dilakukandengan perbesaran 1000x dengan minyak imersi.
Hasil pengamatan morfologi bakteri bentuk bulat Gram positif dan bakteri bentuk batang Gram positif dan negatif dapat dilihat pada Gambar 15, 16 dan 17.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
41
1. Bakteri Bentuk Bulat Gram Positif
A B
Gambar 15. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk bulat Gram positif (perbesaran 1000x), (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk bulat Gram positif
Dari gambar 15 dapat dilihat ciri-ciri morfologi bakteri bentuk bulat Gram positif adalah sebagai berikut :
Bentuk koloni : bulat
Warna koloni : krem
Bentuk tepian : rata
Morfologi sel : bulat
Susunan sel : bergerombol
Warna pengecatan Gram : ungu
SifatGram : positif
2. Bakteri Bentuk BatangGram Positif
commit to user
Gambar 16. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk batang Gram positif (perbesaran 1000x), (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk batang Grampositif
Dari gambar 16 dapat dilihat ciri-ciri morfologi bakteri bentuk batang Gram positif adalah sebagai berikut
Bentuk koloni : bulat
Warna koloni : krem
Morfologi sel : batang
Susunan sel : berderet
Bentuk tepian : berombak
Warna pengecatan Gram : ungu
SifatGram : positif
3. Bakteri Bentuk BatangGram Negatif
A B
Gambar 17. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk batang Gram negatif (perbesaran 1000x), (B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk batang Gram negatif
Dari gambar 17 dilihat ciri-ciri morfologi bakteri bentuk batang Gram negatif adalah sebagai berikut
Bentuk koloni : bulat
Warna koloni : krem
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
43
Susunan sel : monobasil
Bentuk tepian : berombak
Warna pengecatan Gram : merah
SifatGram : negatif
E. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak
Ekstrak etanol biji pinang dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) dibuat seri konsentrasi 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan 100%.Sampel dilarutkan dalam DMSO karena DMSO dapat melarutkan ekstraksecara sempurna.Selain itu DMSO tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri (Kustyaningsih, 2004).