TOPIK I: LAB PATOLOGI KLINIK Sesi
DARAH RUTIN
1. PEMERIKSAAN KADAR HEMOGLOBIN A Metode Sahl
Prinsip pemeriksaan :
Mengukur kadar Hb berdasar warna yang terjadi akibat perubahan Hb menjadi hematin-asam setelah penambahan HCl 0,1 N. Dengan mengencerkan larutan campuran tersebut dengan akuades sampai warnanya sama dengan warna batang gelas standard, kadar hemoglobin dapat ditentukan.
Alat dan reagen yang digunakan :
- Pipet sahli 20 ul - Larutan HCl 0,1 N - Hemoglobinometer Sahli - Akuades
- Batang pengaduk dari kaca - Pipet untuk akuades Sampel :
- Darah kapiler - Darah vena Cara pemeriksaan :
Isi tabung pengencer dengan HCl 0,1 N sampai angka 2
Dengan pipet Hb hisap darah sampai angka 20 ul jangan sampai ada gelembung udara.
Hapus darah yang apa pada ujung pipet.
Tuang darah ke dalam tabung pengecer, bilas HCl bila masih ada darah dalam pipet.
Biarkan 1 menit
Tambahkan aquadest tetes demi tetes, aduk dengan batang kaca pengaduk. Bandingkan larutan dalam tabung pengencer dengan warna larutam
standard.
Bila sudah sama warnanya penambahan aquadest dihentikan, baca kadar Hb pada skala yang ada di tabung pengencer.
Catatan:
Bila menggunakan darah kapiler kemungkinan akan memberikan hasil yang lebih rendah bila dipijit-pijit pada waktu pengeluaran darah setelah selesai penusukan.
B. Sianmethemoglobin (Kolorimetri/Fotometrik)
Prinsip Pemeriksaan :
Hemoglobin oleh K3Fe(CN)6 akan diubah menjadi methemoglobin yang kemudian akan menjadi hemoglobin sianida (HiCN) oleh KCN. Penambahan KH2PO4 untuk mengatur pH larutan. Penambahan non ionic detergent bertujuan mempercepat lisis eritrosit dan mengurangi kekeruhan HiCN yang terjadi. Waktu perubahan hemoglobin menjadi HiCN dengan cara ini sangat cepat yaitu 3 menit. Intensitas warna yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 540 nm.
Alat yang diperlukan adalah : - pipet volumetrik 5,0 ml
- pipet sahli 20 ul - spektrofotometer
Larutan Drabkin, ,yang terdiri dari :
KH2PO4 140 mg
KCN 50 mg
K3 Fe (CN)6 200 mg
Aquadest 1000 ml
Non ionic detergent 0,5 – 1 ml Stabilitas :
Tahan 3 minggu – 1 bulan
Simpan dalam botol berwarna coklat, ditempat yang sejuk. Cara kerja :
- Spektrofotometer dinyalakan. - Panjang gelombang 540 nm Hg - 3 ml larutan Drabkin sebagai Blanko
- 5 ml larutan Drabkin + 20 ul darah sampel diinkubasi selama 3 - 5 menit - Baca nilai absorbensi/serapan pada spektrofotometer
- Kadar hemoglobin ditentukan dari perbandingan absorbansinya dengan absorbansi standard atau dibaca dengan kurva tera yang telah dibuat.
Sumber kesalahan :
- Stasis vena pada waktu pengambilan darah menyebabkan kadar hemoglobin lebih tinggi dari seharusnya, sebaliknya penggunaan darah kapiler menyebabkan kontaminasi cairan jaringan yang menyebabkan kadar hemoglobin lebih rendah dari seharusnya.
- Terjadinya bekuan darah .
- Spektrofotometer yang kurang baik, misalnya pengaturan panjang gelombang yang tidak tepat. Untuk itu perlu dikalibrasi panjang gelombang. Perubahan pada spektrofotometer mengharuskan kita untuk membuat kurva standard baru.
- Darah yang lipemik dapat menyebabkan hasil yang lebih tinggi dari seharusnya.
- Adanya lekositosis berat (> 50.000 /ul) menyebabkan hasil ukuran kadar hemoglobin lebih tinggi dari seharusnya.
Nilai rujukan menurutDacie :
* Dewasa laki-laki : 12,5 – 18,0 gr % * Dewasa wanita : 11,5 – 16,5 gr % * Bayi < 3 bulan : 13,5 – 19,5 gr % * Bayi > 3 bulan : 9,5 – 13,5 gr % * Umur 1 tahun : 10,5 – 13,5 gr % * Umur 3 – 6 tahun : 12,0 – 14,0 gr % * Umur 10 – 12 tahun : 11,5 – 14,5 gr % 2.2. JUMLAH LEKOSIT Prinsip percobaan :
Darah diencerkan dengan larutan asam lemah maka sel-sel eritrosit akan mengalami hemolisis serta darah menjadi encer, tinggallah sel-sel lekosit sehingga lebih mudah dihitung.
Alat dan reagen yang dipergunakan :
1. Hemositometer : - Bilik Hitung Improved Neubaur - Pipet Leukosit
1. Larutan pengencer Turk : - asam asetat glacial 3ml - gentian violet 1% 1ml - akuades 100 ml 2. Mikroskop cahaya
Sampel : darah EDTA atau darah kapiler
Cara kerja :
- Bilik hitung dicari dengan mikroskop dalam posisi rata, gunakan pembesaran kecil lensa obyektif 10 kali dan lensa okuler 10 kali (10 x 10). Cari 4 bidang kotak besar yang masing-masing luasnya 1 mm3 yaitu bidang 1, 3, 7, dan 9 (lihat gambar)
- Hisap darah dengan pipet lekosit sampai tanda 0,5, bila lebih letakkan ujung pipet pada bahan yang tidak meresap, misal : kuku atau plastik, sampai darah tepat pada tanda 0,5. Bersihkan ujung luar pipet tersebut dengan tissue. Kemudian hisaplah larutan pengencer sampai tanda 11 (pengenceran 1 : 20 ). Peganglah pipet lekosit tersebut sedemikian rupa sehingga kedua ujung pipet terletak diantara ibu jari dan telunjuk tangan kanan. Kocoklah selama 3 menit, agar semua eritrosit lisis. Cara lain pengencer sebanyak 0,38 ml dimasukkan dengan menggunakan pipet volumetrik 0,5 ml ke dalam tabung ukuran 75 x 10 mm, kemudian tambahkan 20 ul darah EDTA dengan pipet sahli ke dalam tabung tersebut (pengenceran 1 : 20 ).
- Pengisian bilik hitung : buanglah 4 tetes pertama dan letakkan ujung pipet pada bilik hitung tepat batas kaca penutup. Isikan ke dalam bilik hitung tersebut dan biarkan selama 3 menit agar lekosit mengendap.
Cara menghitung :
Hitunglah sel-sel lekosit pada ke-4 kotak besar bilik hitung. Pada setiap kotak sel-sel yang menempel pada sisi kiri/bawah ikut dihitung sedangkan yang menempel di sisi kanan/atas tidak dihitung (lihat gambar ).
Hitung lekosit/mmk = jumlah sel yang dihitung dalam 4 kotak besar x pengenceran (20) dibagi volume kotak besar ( 4x0,1x1x1)mmk = 0,4 mmk.
Hitung
leukosit/mm3 =
Jumlah sel yang dihitung (N) x pengenceran (20) Vol yang dihitung (0,4 mm3)
= Nx50/mm3
Nilai rujukan menurut Dacie :
- Dewasa pria : 5 – 11 ribu/ mm3 - Dewasa wanita : 5 – 11 ribu / mm3
- Bayi : 10 – 25 ribu / mm3
- 1 tahun : 6 – 18 ribu / mm3
- 12 tahun : 4,5 – 13 ribu / mm3
Gambar 11 : Kamar hitung improved Neubaur kotak leukosit
Gambar 12: Cara menghitung lekosit di dalam kamar hitung Kesalahan :
Lebih kecil dibandingkan eritrosit Kesalahan biasanya oleh karena :
- Alat - Reagensia - Sampel - Pemeriksa Perawatan alat : Pipet Leukosit :
Begitu selesai dipergunakan harus segera dicuci, dengan aquadest dan disemprot aceton. Bila gagal rendam dalam larutan (salah satu) :
-Ethanol 95% -Asam Acetat 0,5%
-Dikromat cleaning solution -Larutan sadium Bicarbonat 1% Bilik Hitung :
- Bersihkan secepat mungkin
- Rendam dalam larutan deterjen 2 – 3 jam - Bilas air
- Bilas alkohol
- Keringkan dengan kain halus
2.3. LAJU ENDAP DARAH (LED)
Macam pemeriksaan Laju Endap Darah : 1. Westergreen
2. Wintrobe Prinsip percobaan :
Apabila sejumlah darah diberi antikoagulan, diletakkan dalam tabung gelas dalam posisi tegak lurus, maka sel-sel akan mengendap, sebaliknya plasma akan bergerak keatas. Hal ini oleh karena perbedan berat jenis.
1. WESTERGREEN