TINJAUAN PUSTAKA
2) Pemeriksaan secara laboratorium
Pemeriksaan secara laboratorium dapat dibedakan dalam beberapa metode yaitu antara lain pemeriksaan secara mikroskopis, serologi dan molekuler.
a Pemeriksaan secara mikroskopis atau konvensional
Fasciolosis kronis dapat didiagnosis melalui pemeriksaan telur dalam feses dibawah mikroskop. Teknik konvensional dengan pulasan sederhana atau metode konsentrasi, dapat dibedakan atas pengendapan (sedimentasi), pengapungan (floating), saringan bertingkat. Metode konsentrasi adalah suatu metode yang dirancang untuk memisahkan organisme protozoa dengan telur cacing dari kotoran feses melalui perbedaan berat jenis (Taylor 1964). Penegakkan diagnosis pasti, dilakukan dengan pemeriksaan feses, cairan duodenum, atau cairan empedu hospes untuk menemukan telur cacing Fasciola dengan penghitungan jumlah telur tiap gram feses. Penemuan metaserkaria pada rumput, membantu menegakkan diagnosis terutama fasciolosis jaringan dan fascioliasis dalam periode prepaten. Diagnosa infeksi secara konvensional didasarkan pada penemuan telur cacing yang dikeluarkan oleh cacing dewasa di dalam feses hewan atau manusia (Garcia et al. 2009).
b Pemeriksaan secara serologi
Pemeriksaan secara serologi didasarkan pada penggunaan antibodi dengan target antigen parasit yang dicari, merupakan metode yang sensitive dan spesifik. (Teledo et al. 2003; Charlier et al. 2008). Alternatif metode yang dapat digunakan yaitu enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) ini umum digunakan untuk mendeteksi keberadaan antibodi atau antigen dalam sampel dan relatif sederhana (Jaswir 2010).
c Pemeriksaan secara molekuler
Teknik pemeriksaan secara molekuler umumnya dilakukan dalam penelitian dan seputar dunia laboratorium dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR merupakan teknik untuk memperkuat satu salinan tunggal atau beberapa potong DNA, sebagai primer, di beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan gandaan urutan DNA tertentu. PCR dapat dimodifikasi secara luas untuk berbagai macam manipulasi genetik. teknik PCR dapat digunakan untuk memverifikasi, sertifikasi dan mendeteksi kebanyakan protein hewani (Jaswir 2010).
11
Antibodi Poliklonal
Antibodi merupakan protein yang dibuat oleh semua spesies hewan dan merupakan bagian dari sistem tanggap kebal terhadap substansi asing. Respon imun (respon humoral) terjadi akibat antigen yang merupakan substansi asing menggertak sel T sebagai helper sehingga berdiferensiasi menjadi limfokin. Limfokin berinteraksi dengan sel limfosit B, dan berdiferensiasi menjadi sel plasma dan sel memori. Antibodi adalah molekul protein yang dihasilkan oleh sel plasma
.
Sel limfosit T yang terdiri dari sel limfosit T sitotoksik dan sel limfosit T helper. Sel limfosit T sitotoksik berperan dalam menghancurkan antigen intraseluler sedangkan sel limfosit T helper berperan untuk membantu sel limfosit B (Black 2005). Mekanisme kerja antibodi untuk mempercepat penghancuran dan penyingkiran antigen dengan netralisasi, presipitasi, agglutinasi, serta lisis (Guyton dan Hall 2007).Antibodi poliklonal diperoleh dengan cara melakukan imunisasi secara sengaja terhadap hewan dengan suatu imunogen spesifik (hiperimunisasi). Antibodi poliklonal memiliki campuran kompleks antibodi dengan spesifitas, afinitas, dan isotipe yang berbeda serta keterbatasan produksi karena dibatasi oleh umur hewan yang digunakan (Zola 1987). Antibodi poliklonal memiliki reaktivitas multipel yaitu dapat menangkap sejumlah epitop (antigen determinan) yang berbeda pada antigen. Reaktivitas multipel antibodi poliklonal dapat menimbulkan reaksi silang. Reaksi silang ini dapat terjadi karena epitop yang sama dimiliki oleh antigen yang berbeda atau epitop yang secara struktur mirip atau memiliki keserupaan dengan epitop pembuat peka (priming epitop) yang dikenali oleh antibodi (Smith 1995). Antibodi dapat digunakan sebagai reagensia untuk mengukur, mendeteksi dan memurnikan molekul biologis bahkan untuk pengobatan.
Antibodi terdiri dari unit dasar yang disebut immunoglobulin (Ig). Ig merupakan penyusun antibodi yang memiliki dua karakteristik yaitu kimia dan biologi (Black 2005). Ig secara kimia berupa rantai polipeptida (dua rantai ringan dan dua rantai berat) yang tersusun dengan bentuk khusus (Gambar 4). Produksi Ig secara biologis distimulasi oleh antigen dan memiliki reaksi yang spesifik (Barriga 1981). Ada lima golongan Ig yaitu IgM, IgG, IgA, IgE dan IgD. Diantara lima golongan tersebut, IgG umum digunakan dalam immunodiagnostik. Hal ini disebabkan IgG
memiliki presentasi terbanyak yaitu 70-75% di dalam serum normal dibandingkan IgM (antibodi pertama yang muncul dalam respon primer), IgA, IgE dan IgD. IgG memiliki struktur monomer dengan berat molekul 146.000 dalton serta merupakan antibodi utama dari respon imun sekunder. Molekul imunoglobulin yang berbeda dapat memiliki sifat mengikat antigen yang berbeda karena VH yang berbeda dan daerah VL (De Buysscher dan Patterson 1995). Secara struktural, IgG memiliki empat rantai polipeptida terbagi atas dua rantai berat identik dengan berat molekul 50.000 dalton serta dua rantai ringan dengan berat molekul 25.000 dalton. Antara rantai berat dan rantai ringan polipeptida dihubungkan oleh ikatan disulfida yang terdapat pada bagian engsel (hinge region). Rantai berat dan ringan dari IgG masing-masing memiliki bagian konstan atau tetap dan bagian yang dapat berubah atau variable, Bagian yang dapat berubah (variable) berfungsi khusus untuk melekat antigen pada struktur IgG. Bagian konstan menentukan sifat biologis IgG seperti penyebaran IgG dalam jaringan, pelekatan IgG pada struktur jaringan spesifik, pelekatan pada kompleks komplemen, serta kemudahan IgG dalam melewati membran (Guyton dan Hall 2007).
Fc: Fragment crystallization, FAB: Fragment antigen binding, CH1 CH2 CH3 : constant regions, HV VL : variable domains, FV : Fragment variable, Warna hijau: Rantai berat, Warna biru: Rantai ringan, bulat biru : Carbohydrate.
Gambar 4 Struktur IgG pada mamalia (Jose 2000).
Pada ayam IgG lebih dikenal sebagai IgY. IgY merupakan antibodi humoral utama pada unggas. Pada ayam IgA dan IgM memiliki kemiripan dengan IgA dan IgM mamalia dalam hal berat molekul, morfologi, dan mobilitas imunoelektroporetik
13 (Tarigan 2003). IgY pada ayam tidak memiliki persamaan imunologis dengan IgG mamalia, namun mempunyai struktur yang sama yaitu memiliki dua rantai ringan dan dua rantai berat, urutan DNA IgY menyerupai urutan DNA pada IgE manusia (Carlender 2002). IgY ditemukan oleh Klemperer tahun 1893, yang menggambarkan adanya kekebalan pasif terhadap toksin tetanus yang diturunkan dari induk ke anak ayam. IgY terdapat dalam kuning telur dan serum dalam bentuk molekul immunoglobulin dengan konsentrasi sekitar 10-20 mg/ml (Davalos et al. 2001). IgY lebih tahan terhadap suhu dan perubahan pH dibandingkan IgG, namun sangat sensitive terhadap denaturasi. Aktifitas IgY dapat dipertahankan jika disimpan pada suhu 370C untuk jangka waktu enam bulan, bahkan dapat dipertahankan selama 10 tahun jika disimpan pada suhu 40C (Larsson et al. 1993). Inkubasi pada pH lebih dari 4 masih dapat ditoleransi, namun pada pH 2 suhu 370
Mekanisme pembentukan IgY dalam serum darah dan kuning telur memiliki kemiripan dengan pembentukan IgG pada mamalia. Namun terdapat beberapa perbedaan antara IgY dengan IgG berupa ukuran yang lebih besar, sifat keasaman, kerapatan molekul yang lebih rendah (Higgins 1995; Szabo et al. 1998). IgY dapat mengenali lebih banyak epitop antigenik dibandingkan dengan antibodi yang diproduksi mamalia. IgY juga mampu mengikat antibodi sekunder hingga tiga sampai lima kali lebih kuat dari IgG. IgY tidak mengikat reseptor permukaan sel Fc, tidak mengikat protein A dan G (Schmidt et al. 1993). Perbedaan dalam interaksi molekuler menjadi keuntungan besar untuk mengaplikasikan antibodi IgY dalam berbagai penelitian, diagnostik kedokteran, bioteknologi serta menjadi antibodi alternative unggulan untuk immunoglobulin konvensional (Hodek et al. 2003; Michael et al. 2010).
C aktivasi IgY menurun drastis. Penurunan aktivitas tersebut disebabkan oleh perubahan konformasi (Michael et al. 2010).
Antigen Ekskretori dan Sekretori (ES)
Antigen (antibody generating substances) adalah suatu senyawa atau substansi yang dapat menggertak sistem imunitas dapatan pada inang atau individu. Antigen dapat berupa polisakarida, protein, lemak, asam inti atau lipopolisakarida, maupun lipoprotein. Protein merupakan antigen yang terbaik karena ukuran dan kerumitan strukturnya. Hampir semua protein berat molekulnya lebih besar dari 8000
dalton bersifat antigenik. Pembentukan sifat antigenik tergantung kepada pengulangan kelompok molekul secara regular, yang disebut epitop (antigenik determinan) pada permukaan molekul besar (Guyton dan Hall 2007).
ES merupakan antigen protektif yang dapat memicu tanggap kebal inang definitif (McKeand et al. 1995). Selain antigen ES, parasit memiliki antigen somatik dan antigen permukaan yang dapat dikenali oleh inangnya. Antigen somatik hanya dapat dikenali oleh inangnya jika cacing tersebut telah mati atau dihancurkan, sedangkan antigen permukaan selalu berubah seiring dengan rangkaian perkembangan cacing yang mengalami moulting sepanjang hidupnya sehingga menyulitkan inang defenitif dalam memberi respon tanggap kebal. Antigen ES mempunyai sifat yang lebih dapat dikenali oleh sistem tanggap kebal daripada antigen somatik dan antigen permukaan, sehingga diduga lebih protektif untuk memicu respon tanggap kebal (Chowdhury 1994).
Antigen ES mengandung glikoprotein yang menutupi kulit cacing, juga mengandung sebagian kecil enzim, yang dilepaskan secara konstan sehingga mempermudah migrasi ke jaringan inang (Bird 1991). Analisis dua dimensi gel eektroforesis mengindikasikan bahwa F. hepatica melepaskan sekitar 60 protein dalam substansi ES. Di antaranya ada 29 protein yang merupakan protein esensial cathepsin L, superoxide dismuthase, thioredoxin peroxidase, glutathione S transferase, dan protein yang terikat pada asam lemak. Cathepsin L menempati jumlah yang paling banyak ditemukan dalam ES Fasciola sp (Ridi et al. 2007).
Fasciola sp. menghasilkan berbagai jenis antigen ES yang berbeda-beda pada setiap stadium hidupnya yang beredar pada sirkulasi inangnya. Antigen tersebut menjadi studi terbaik dan potensial untuk diagnostik dikenal dengan gut-associated antigen. Molekul tersebut berasal dari usus parasit dan dilepas ke sirkulasi inang melalui regurgitasi regular dalam pencernaan usus. Kehadiran ES menjadi indikasi infeksi aktif cacing yang masih hidup (Shehab et al. 1999).
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Nopember 2009 hingga Januari 2011, di bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan (PEK), Departemen Ilmu Penyakit Hewan & Kesmavet. Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, di Bogor.
Prosedur Penelitian
Pengembangan metode ELISA untuk mendeteksi keberadaan koproantigen F. gigantica dilakukan melalui lima tahapan : 1) Isolasi, produksi dan karakterisasi antigen ES F. gigantica. 2) Produksi dan deteksi poliklonal antibodi. 3) Optimasi ELISA. 4) Uji spesifisitas dan sensitifitas. 5) Uji ELISA dengan sampel feses dari lapangan.
Tahap 1 Isolasi,Produksi dan Karakterisasi Antigen ES F. gigantica
Cacing hati (F. gigantica) dikoleksi dari delapan hati sapi yang disembelih di Rumah Potong Hewan (RPH) Palu dan Purwodadi. Organ hati dipreparir di sepanjang saluran empedu untuk mengeluarkan cacing. Jaringan hati dibagi menjadi potongan-potongan kecil untuk memudahkan pengambilan cacing. Cacing hati (F. gigantica) dewasa yang dikoleksi dari hati sapi dicuci tiga kali dalam larutan NaCl fisiologis, untuk menghilangkan sisa jaringan dan empedu yang menempel ditubuh cacing. Kondisi fisik cacing diamati dengan mikroskop stereo atau lup. Cacing yang masih hidup dan utuh dikumpulkan dalam wadah berisi NaCl fisiologis. Cacing tersebut selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung 50 ml berisi larutan Phosphate Buffer Saline (PBS) kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 15-20 menit (50 cacing dalam 100 ml PBS). Cacing yang telah bersih dipindahkan ke dalam media RPMI 1640 yang mengandung antibiotik dan diinkubasikan pada suhu 370C selama 20 menit. Cacing hati yang masih hidup dipindahkan ke dalam medium RPMI 1640 yang baru dan diinkubasi selama 4 jam suhu 370C (dua ekor cacing dalam 1 ml RPMI). Larutan RPMI yang mengandung antigen ES dipisahkan dari cacingnya, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500 G pada suhu 4ºC selama 10 menit. Larutan dikumpulkan supernatannya dan dibuang peletnya.
Supernatan hasil sentrifugasi dipekatkan dengan penambahan Ammonium sulfat 40% (w/v) sambil diaduk dengan batang pengaduk magnet selama 24 jam pada suhu 4ºC. Ekskretosi–sekretori yang telah dipekatkan dimurnikan dengan cara didialisis menggunakan membrane selulosa (Sigma®) dalam larutan PBS selama empat jam, volume PBS yang digunakan sebanyak 100 kali volume larutan yang didialisis. Buffer pendialisis diganti setiap satu jam. Hasil dialisis merupakan antigen ES yang telah dimurnikan, selanjutnya antigen ES tersebut disimpan dalam freezer -200
Konsentrasi protein antigen ES yang diperoleh diukur menggunakan metode Bradford (1976). Karakterisasi protein antigen ES diamati dengan melarikan protein tersebut menggunakan metode Sodium Deodecil Sulphate-Poly Acrilamide Gel Elektrophoresis (SDS-PAGE) (Laemmli 1970).
C sampai saat akan digunakan.
Tahap 2 Produksi dan Deteksi Poliklonal Antibodi
Dalam penelitian ini digunakan dua jenis poliklonal antibodi yaitu IgG yang berasal dari kelinci dan IgY yang berasal dari kuning telur ayam. Imunoglobulin G
anti ES F. gigantica kerbau diperoleh dengan cara menyuntikan antigen protein ES F. gigantica asal kerbau pada dua ekor kelinci percobaan. Pada penelitian ini
digunakan dua ekor kelinci ras white New Zaeland umur dua bulan, berat badan masing-masing satu kg. Sebelum digunakan hewan coba dipelihara dan diberi obat anti cacing agar bebas dari penyakit cacing dan ivomex® agar tidak terkena infeksi penyakit parasit. Dosis imunisasi masing-masing kelinci adalah 150 µl/ekor. Imunisasi pertama dilakukan dengan rute intra vena (i.v). Imunisasi kedua dilakukan seminggu setelah imunisasi pertama dengan rute subcutan menggunakan Freud adjuvan komplit dengan perbandingan antara Antigen dan adjuvan sama banyak. Penyuntikan ketiga sampai kelima dengan interval tiga minggu melalui rute subkutan (s.c), menggunakan Frued adjuvan inkomplit dengan perbandingan sama.
Deteksi poliklonal antibodi dilakukan dengan, mengambil sampel serum dari vena auricularis pada telinga, seminggu setelah penyuntikan kedua hingga minggu ke 16. Pemeriksaan kualitatif metode Agar Gel Precipitation Test (AGPT) menurut Eisen (1973) digunakan untuk mendeteksi keberadaan antibodi anti ES dari kelinci. Hewan coba yang telah membentuk antibodi (IgG) dalam darah terhadap antigen ES F. gigantica kerbau, diambil serum (darahnya) dimasukkan ke dalam inkubator suhu
17
37oC dengan posisi miring selama 30 menit. Kemudian disimpan dalam refrigerator semalam pada suhu 4o
Serum yang diperoleh dimurnikan untuk mendapatkan IgG menggunakan Montage
C. Serum dikumpulkan menggunakan mikropipet. Bila perlu, darah disentrifus dengan kecepatan 2000 x g selama 15 menit.
®
Antibody Purification Kit and Spin Columns with PROSEP®-A Media. Media PROSEP®-A yang digunakan dipre-ekuilibrasi menggunakan 10 ml Binding Buffer A dengan mensentrifuse spin column dengan kecepatan 500 x g selama 30 menit pada suhu 4oC. Sampel berupa serum kelinci anti ES F.gigantica kerbau disaring menggunakan 0.2 µm Steriflip-GP filter. Kemudian 10 ml serum yang telah difiltrasi ditambahkan dengan 10 ml Binding Buffer A (perbandingan 1:1 v/v) disentrifus dengan kecepatan 500 x g selama 30 menit suhu 4oC. Setelah 30 menit, supernatan didasar tabung dibuang kemudian spin column dibilas menggunakan 20 ml Binding Buffer A yang disentrifus dengan kecepatan 500 x g selama 30 menit pada suhu 4oC untuk menghilangkan kontaminan yang tidak terikat. Setelah itu, sebanyak 10 ml Elution Buffer B2 ditambahkan langsung kedalam spin column dalam tabung steril baru yang telah diisi 1,3 ml Neutralization Buffer C yang disentrifus dengan kecepatan 4500 x g selama 40 menit pada suhu 4oC. Supernatan didasar tabung yang mengandung IgG diambil, kemudian difiltrasi menggunakan Amicon® 30.000 yang disetrifus dengan kecepatan 4500 x g selama 25 menit pada suhu 4oC. Supernatan berupa IgG yang tertinggal didalam filter disimpan dalam tabung-tabung mikro volume 1.5 ml, disimpan dalam suhu -20o
Poliklonal antibodi immunoglobulin Y (IgY) dari kuning telur ayam adalah kuning telur yang telah diproduksi pada penelitian Satrija et al. (2009). Kuning telur diperiksa secara kualitatif dengan metode AGPT sama seperti IgG, untuk mendeteksi keberadaan poliklonal antibodi IgY. Setelah poliklonal antibodi IgY terdeteksi secara kualitatif, selanjutnya dilakukan pemurnian menggunakan Kit EGGstart® IgY Perrification System (PROMEGA).
C. Konsentrasi IgG yang telah dipurifikasi diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang 595 nm dengan metode Bradford.
Telur yang akan dimurnikan terlebih dahulu dikondisikan dalam suhu ruang beberapa saat sebelum dipecah kerabangnya. Kemudian kuning telur dipisahkan dari putih telur, selanjutnya membrane vitelin kuning telur ditusuk dengan jarum steril agar cairan kuning telur keluar. Cairan kuning yang keluar ditampung dalam gelas
piala steril dan ditimbang beratnya. Larutan presipitasi A ditambahkan sebanyak tiga kali volume kuning telur dan diaduk selama 5 menit untuk menggumpalkan lemak, lalu sentrifuse dengan kecepatan 10.000 g, selama 15 menit pada suhu 40C. Supernatan disaring melalui 4 lapis kain kasa steril lalu perlahan-lahan diaduk dan ditambahkan larutan B sebanyak 1/3 dari volume filtrat. Larutan tersebut terus diaduk selama 5 menit kemudian disentrifuse dengan kecepatan 10.000 g selama 15 menit pada suhu 40C. Pellet presipitat yang terkumpul didasar tabung dipindahkan ke tabung lain, supernatan dibuang. Kemurnian IgY yang didapat adalah sekitar 63%, untuk meningkatkan menjadi 90% dengan cara memproses ulang pellet presipitat dengan penambahan larutan B sebanyak 1/3 dari volume filtrat. Sebelum dilakukan pengulangan langkah selanjutnya, pellet presipitat yang terkumpul ditambah dengan PBS sebanyak volume awal kuning telur. Larutan dihomogenkan lalu di aliquot 1 ml dalam tabung mikro. Konsentrsi IgY yang telah dimurnikan dihitung menggunakan metode Bradford (1976), dan sebelum digunakan disimpan dalam freezer -200