Percobaan kali ini bertujuan untuk melakukan pemisahan metabolit sekunder dari hasil ekstraksi Rhei radix dengan metode kromatorafi kolom dipercepat dan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Pemisahan metabolit sekunder dilakukan melalui dua tahap yaitu fraksinasi menggunakan kromatografi kolom dipercepat atau fast chromatography menggunakan elusi gradien dengan kepolaran eluen yang terus ditingkatkan serta untuk menganalisis metabolit sekunder dari simplisia digunakan kromatografi lapis tipis.
Hal yang pertama dilakukan dalam pemisahan ekstrak adalah preparasi kolom untuk fast chromatography. Pertama-tama penyangga kolom dicuci dan dibilas hingga bersih sampai kering. Hal tersebut bertujuan agar tidak ada zat pengotor di dalam penyangga kolom yang akan mempengaruhi hasil percobaan. Pada dasar kolom telah terpasang kaca masir yang merupakan suatu penyangga berpori yang berfungsi untuk menahan fasa diam. Kemudian dimasukkan fasa diam berupa silika gel sebanyak 30 gram secara hati-hati dan disebar secara merata dan dimampatkan dengan menggunakan spatula. Ketersebaran silika gel dalam penyangga kolom akan sangat mempengaruhi dari efisiensi pemisahan yang akan dilakukan karena bila pada fasa terdapat udara ataupun ketidaksamaan fasa diam seperti tidak samanya kemampatan akan membuat derajat retensi dan kecepatan gerak dari eluen tidak stabil sehingga akan mengakibatkan kecepatan gerak sampel tidak merata.
Setelah silika gel dimampatkan oleh spatula, kemudian dimasukkan eluen yang bersifat non-polar yaitu n-heksana sebanyak 100 mL. Penggunaan n-heksana dengan volume tersebut ditujukan sebagai eluen non-polar sekaligus sebagai pembasah silika gel karena eluen yang pertama kali dipakai untuk mengelusi kolom adalah 100 mL h-heksan dan agar menghasilkan bubur penjerap (silika gel) yang homogen sebelum dilakukan penghisapan menggunakan pompa vakum. Pompa vakum pada dasarnya bekerja melalui mekanisme mengurangi takanan udara di dalam kolom sehingga akibat perbedaan tekanan ini, proses pergerakan
eluen dalam kolom meningkat dengan pesat. Penjerap (silika gel) perlu dibuat dalam bentuk bubur agar dihasilkan kolom yang baik dan tidak mudah retak. Kolom yang dielusi dengan larutan pengelusi juga dimaksudkan untuk memperoleh kolom yang stabil. Kolom yang stabil diperoleh apabila tetesan yang dihasilkan sudah konstan. Setelah dihasilkan kolom yang mantap, kolom tidak boleh sampai mengering. Kolom dijaga agar tidak kering dan tidak retak dengan cara terus dielusi. Karena jika kolom kering dan retak, kolom yang sudah mampat akan rusak dan berongga. Jika terdapat rongga dalam kolom, pita yang terbentuk dalam kolom tidak akan rata dan proses keluarnya efluen tidak akan bersamaan.
Setelah silika gel siap, maka dimasukkan 1 gram ekstrak yang telah terlebih dahulu digerus dengan 10 gram silika gel. Penggerusan ini dimaksudkan untuk mengeringkan dan menghomogenkan ekstrak dengan silika sehingga bila diletakkan pada kolom, pemisahan dapat terjadi secara efektif. Penggerusan ekstrak dengan fasa diam ini pun merupakan salah satu metode pemisahan yaitu metode pemisahan ekstrak kering. Silika gel bersifat polar karena mempunyai gugus hidrofil yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa dalam ekstrak yang juga mempunyai gugus hidrofil. Silika gel yang telah digerus bersama dengan ekstrak kental akan menyebabkan silika gel akan berikatan dengan metabolit yang bersifat hidrofil di dalam ekstrak sehingga pada saat dielusi oleh pelarut non polar, metabolit yang bersifat lebih polar akan tertahan dalam kolom dan baru akan turun ketika dielusi oleh pelarut yang lebih polar. Ekstrak yang sudah digerus dengan silika kemudian dimasukkan diatas kolom secara merata. Diperhatikan keberadaan silika gel sebagai penjerap di semua tempat dalam kolom, karena adanya rongga-rongga udara atau ketidakbersamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk pada proses pemisahan.
Setelah ekstrak menyerap ke dalam kolom, larutan pengelusi disiapkan. Eluen yang dibgunakan adalah n-heksan dan etil asetat dengan berbagai perbandingan, yaitu 100:0 ; 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 ; 50:50 ; 40:60 ; 30:70 ; 20:80 ; 10:90 ; 0:100. Eluen tersebut disusun pada 11 komposisi yang berbeda dengan kepolaran yang terus dinaikkan. Hal tersebut bertujuan agar eluen dapat
mengelusi seluruh metabolit yang ada dalam ekstrak yang mempunyai kepolaran yang berbeda sehingga didapat fraksi yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda-beda tetapi metabolit dalam satu fraksi memiliki kepolaran yang tidak jauh berbeda. N-heksan merupakan pelarut non polar sedangkan etil asetat adalah
pelarut semi polar. Fase diam yang digunakan, yaitu silika gel yang bersifat polar sehingga dapat menahan metabolit dalam ekstrak yang bersifat hidrofilik dengan membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa dalam campuran yang juga mengandung gugus hidrofilik. Pelarut non polar (n-heksan) digunakan untuk membawa metabolit dari ekstrak yang bersifat non polar sehingga metabolit yang bersifat non polar turun bersama eluen terlebih dahulu dan metabolit yang tingkat kepolarannya lebih tinggi tertahan pada kolom sehingga metabolit dapat dipisahkan berdasarkan kepolarannya. Pelarut semi polar (etil asetat) digunakan untuk mengelusi metabolit yang kepolarannya lebih tinggi.
Setelah kolom dielusi oleh 11 eluen dengan perbandingan yang berbeda-beda, didapat 11 fraksi hasil pemisahan ekstrak dengan kromatografi cair vakum. Secara organoleptis, fraksi-fraksi memiliki warna yang berbeda-beda. Dimulai dari fraksi larutan bening menjadi coklat tua dengan bau n-heksana dan etil asetat dan bau khas Rhei radix. Fraksi 1-3 berwarna bening, fraksi 4-6 berwarna kuning, fraksi 7-9 berwarna coklat muda, dan fraksi 10-11 berwarna coklat tua. Fraksi-fraksi ini kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan kromatografi lapis tipis.
Pertama-tama pada plat dibuat garis 1 cm dari masing-masing ujung. Titik tempat campuran ditempatkan disebut titik awal. Kemudian dilakukan penotolan sampel dari setiap fraksi pada plat silika gel dan satu totolan untuk ekstrak untuk membandingkan hasil elusi ekstrak dengan sampel fraksi. Ada kemungkinan ditemukan bercak pada fraksi tertentu yang ternyata tidak terlihat di bercak sampel. Hal tersebut dapat dikarenakan tertutupnya warna bercak tersebut oleh warna bercak lain yang lokasinya relatif sama pada sampel awal.
Sampel diletakkan pada titik awal dengan menutulkannya dengan menggunakan suatu kapiler halus dari kaca, dan diusahakan agar luas tutulan sekecil mungkin agar hasil elusi dari satu fraksi tidak bergabung dengan fraksi
yang lain. Beberapa kali penotolan dapat dilakukan pada tempat yang sama agar totolan lebih tebal dan hasil elusi bisa terlihat lebih jelas asalkan lapisan tutulan pertama harus kering dahulu sebelum tutulan selanjutnya. Jumlah tutulan tidak boleh terlalu banyak karena menyebabkan bercak menjadi asimetris, bergabung dengan bercak fraksi lain, dan menyebabkan perubahan pada harga Rf.
Pengembang yang digunakan adalah campuran n-heksan : etilasetat dengan perbandingan 10 : 1. Campuran pelarut dimaksudkan untuk memperoleh kepolaran yang diinginkan agar komponen-komponen terpisah dengan baik. Campuran pelarut dimasukkan ke dalam bejana pengembang dari gelas, pengerjaan dilakukan di dalam bejana tertutup agar tidak terjadi penguapan pelarut dan bejana jenuh oleh uap pelarut. Bila bejana tidak jenuh, akan mempengaruhi harga Rf. Untuk memastikan bejana jenuh sempurna, sebaiknya dinding bejana dilapisi dengan kertas saring, jika kertas tersebut telah basah sempurna, berarti bejana tersebut telah jenuh. Karena keterbatasan waktu dan alat, langkah di atas tidak dilakukan. Tetapi kejenuhan diuji dengan memasukkan tangan ke dalam bejana, jika terasa cukup hangat, berarti bejana sudah cukup jenuh.
Pengembang yang digunakan untuk mengelusi hasil fraksinasi berbeda dengan pengembang yang digunakan ketika KLT hasil ekstraksi. Hal ini disebabkan karena Rf yang didapat dengan menggunakan pengembang etil asetat : metanol : air (100:13,5:10) sangat jauh berbeda dengan Rf yang ada pada literatur, yaitu 0,3 sedangkan yang didapat dari hasil percobaan adalah 0,8. Diduga pengembang yang digunakan terlalu bersifat polar. Karena senyawa rhein yang tidak terikat dengan gula bersifat non polar, maka pengembang diganti dengan n-heksan : etil asetat (10 :1) yang memiliki gradien kepolaran yang lebih signifikan.
Dari hasil percobaan diperoleh harga Rf yang bervariasi untuk setiap bercak, hal ini disebabkan perbedaan kepolaran masing-masing metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak. Selama pengembangan, komponen yang lebih polar akan terikat lebih kuat pada lapisan silika gel sehingga akan tertahan lebih lama, sedangkan komponen yang kurang polar akan cepat bergerak bersama campuran
pelarut (yang relatif kurang polar jika dibandingkan dengan silika gel). Selain harga Rf yang berbeda-beda pada setiap bercak, warna pada tiap bercak pun berbeda-beda. Yang dicari adalah bercak berwarna kuning pada sinar tampak yang akan berubah menjadi pink setelah disemprot dengan penampak bercak KOH 5%.
Metode yang cukup umum digunakan untuk deteksi kromatogram adalah penggunaan sinar UV panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, khususnya untuk noda yang tidak berwarna. Karena bercak pada kromatogram yang diperoleh berwarna, bercak dapat dideteksi pada tiga keadaan, yaitu pada sinar biasa, sinar UV 254 nm dan 366 nm. Untuk fasa diam silika gel biasa, fluoresensi di bawah sinar UV hanya terjadi jika senyawa tersebut berfluoresensi. Tapi bila yang digunakan adalah silika gel berfluoresensi, bercak muncul sebagai bercak hitam. Pada percobaan, diperoleh warna yang berbeda-beda untuk setiap bercak pada setiap fraksi pada berbagai pengamatan, yaitu pada sinar biasa, sinar UV 254 nm dan 366 nm, hal ini disebabkan karena masing-masing bercak memiliki panjang gelombang yang berbeda-beda. Selain itu pola kromatogram juga dilihat dengan penampak bercak (KOH 5%).
Tujuan awal dilakukannya pemisahan ekstrak dengan kromatografi cair vakum dan kromatografi lapis tipis adalah untuk mengetahui pada fasa mana senyawa yang dicari berada. Senyawa yang akan di cari pada praktikum ini adalah rhein dan diduga terdapat pada fraksi 5 dan 6 karena hasil kromatogram pada kedua fraksi tersebut memberikan hasil yang sama dengan ekstrak, yaitu berwarna kuning pada sinar tampak dan berubah menjadi pink setelah disemprot dengan penampak bercak KOH 5%. Oleh karena itu, fraksi 5 dan 6 disatukan dan dikeringkan untuk dianalisis dengan kromatografi lapis tipis preparatif.
C. PEMURNIAN FRAKSI DENGAN METODE KROMATOGRAFI