BAB IV METODE PENELITIAN
4.5 Cara Kerja
4.5.1 Pemrosesan Mg ECAP
Gambar 1.1. Alur Penelitian
4.5. Cara Kerja
4.5.1 Pemrosesan Mg ECAP
Material yang dipakai dibuat .berdasarkan penelitian oleh Karayan dkk pada tahun 2011 yang didapatkan dari batang pure Mg dengan diameter 12 mm dan ketebalan 40 mm yang telah melalui proses ECAP dengan menggunakan cetakan dengan sudut internal 120o dan sudut tepi 20o. Pressing dilakukan sebanyak 6 kali dengan kecepatan plunyer/piston sebesar 0,1 mm/dtk pada suhu 573K. Spesimen kemudian dipotong dengan ketebalan 1 mm. Setelah itu dipoles menggunakan 4000 grid SiC paper dan ethanol.
Kultur Sel Osteoblas Pure
Magnesium
Mg ECAP
Ekstraksi RNA
Kuantifikasi dengan Real time PCR
Pengolahan data Analisis data
Laporan penelitian
4.6.2 Kultur Sel
Human osteoblast cell line MG-63 dilakukan kultur dalam Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco) mengandung 4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamine dan Sodium Pyruvate yang ditambahkan dengan 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 100 U/mL penisilin, dan 100 μg/mL streptomycin (Gibco) pada .suhu 37ºC dengan kondisi atmosfir 5%
CO2 selama 24 jam untuk memberikan kesempatan bagi perlekatan sel.
4.6.3 Perlakuan
Pada kelompok perlakuan diberikan Mg ECAP 0,07 mmol/L dan kelompok kontrol tanpa perlakuan .lalu sampel diambil pada hari ke 1, hari ke 3, hari ke 7 dan hari ke 14.
Gambar 4.1. Persiapan Sampel Penelitian untuk Kelompok Kontrol dan Perlakuan
4.6.4 Analisis Real-Time RT-PCR
RNA total diekstraksi dari sampel kultur cell line human osteoblast MG63 dengan menggunakan GeneJET RNA Purification Kit (Applied Biosystems) sesuai protokol .yang didapat dari kitnya. Untuk menghilangkan DNA genom, digunakan Turbo DNA Free (Applied Biosystems). Kemudian RNA total dihitung konsentrasinya menggunakan spektrofotometer.
Setelah itu dilakukan proses reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) terhadap RNA dari masing-masing sampel dengan RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems) menggunakan campuran random primers. RNA total yang .digunakan maksimal 2 μg/20 μl reaksi RT-PCR hingga didapatkan cDNA dari sampel tersebut.
Analisa ekspresi gen dilakukan pada 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) dengan software SDS v1.4. Komponen reaksi Real-Time PCR yaitu TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems), cDNA dan RT-PCR Grade Water. Untuk target BMP-2, ditambahkan Taqman Gene Expression Assay, Gene: BMP2 (Applied Biosystems Hs00154192_m1) dan .untuk target TGFβ-1, ditambahkan Taqman Gene Expression Assay, Gene: TGFβ1 (Applied Biosystems Hs00998133_m1) serta untuk normalisasi, digunakan Taqman Gene Expression Control Assay, Gene: GAPDH (Applied Biosystems Hs02758991_g1)
Protokol Real-Time PCR yang ditentukan adalah 50°C selama 2 menit dilanjutkan pada 95°C selama 15 menit diikuti dengan 40 cycles 95°C selama 15 detik, 60°C selama 30 detik dan 72°C selama 30 detik.
4.7. Analisa data
Data penelitian dicatat dan dikumpulkan sebagai data primer. Data yang diperoleh, dianalisa secara deskriptif untuk menentukan rata-rata dan simpang baku. Data ditabulasi dan dicatat kemudian dipindahkan ke lembaran data di komputer lalu dianalisis dengan program SPSS 15.0. Jika sebaran data normal
maka menggunakan uji statistik parametrik yaitu uji t tidak berpasangan. Jika sebaran data tidak normal maka menggunakan uji statistik non parametrik yaitu uji Mann-Whitney. Batas nilai kemaknaan digunakan p < 0,05.
BAB V
HASIL PENELITIAN
Penelitian dilakukan pada bulan Juni 2014 di Laboratorium Biologi Molekuler Eijkman dan Laboratorium Oral Biologi FKG UI.
5.1. Hasil Ekspresi TGFβ-1 pada Kultur Osteoblas Setelah Ditambahkan Dengan Mg ECAP Terhadap Kontrol Dalam Waktu 1 hari, 3 hari, 7 hari dan 14 hari
Berdasarkan perhitungan uji normalitas .menggunakan uji Shapiro-Wilk pada tabel 5.1. terhadap variabel TGFβ-1 didapatkan nilai p > 0,05 yang berarti distribusi dari data ini normal.
Uji kemaknaan terhadap nilai ekspresi TGFβ-1 menggunakan uji t-test tidak berpasangan. Apabila nilai p < 0,05 dinyatakan terdapat perbedaan yang bermakna antara dua variabel yang diuji sedangkan nilai p > 0,05 berarti tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara dua variabel yang diuji.
Tabel 5.1. Perbandingan nilai ekspresi TGFβ-1 pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
Konsentrasi Osteoblas MG63
Osteoblas MG63 + Mg
ECAP N P
Hari ke-1 22,174±0,550 25,172±0,165 0,000 Hari ke-3 25,202±0,565 27,974±0,037 0,001 Hari ke-7 26,245±0,081 27,993±0,656 0,010 Hari ke-14 27,740±0,186 29,435±0,678 0,041
Hasil uji kemaknaan pada tabel 5.1 menunjukkan bahwa ada perbedaan bermakna (p < 0,05) antara kelompok kontrol osteoblas MG63 tanpa perlakuan dan kelompok sel osteoblas MG63 dengan perlakuan Mg ECAP, dimana pada hari ke-1, secara deskriptif ekspresi TGFβ-1 pada kelompok dengan perlakuan Mg ECAP lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol. Rerata ekspresi pada biakan
sel osteoblas MG63 kelompok perlakuan 25,172 (SD = 0,165) dan kelompok kontrol 22,174 (SD = 0,550). Hari ke-3 setelah perlakuan, terlihat ekspresi TGFβ-1 pada kelompok perlakuan terjadi peningkatan dengan nilai rerata sebagai berikut: perlakuan 27,974 (SD = 0,037) dan kontrol 25,202 (SD = 0,565).
Ekspresi pada biakan sel osteoblas MG63 7 hari setelah perlakuan menunjukkan peningkatan dimana rerata ekspresi TGFβ-1 kelompok perlakuan 27,993 (SD = 0,656) dan kelompok kontrol 26,245 (SD = 0,081). Serta pada hari ke-14 didapatkan perningkatan dimana rerata kelompok perlakuan sebesar 29,435 (SD = 0,678) dan kelompok kontrol 27,740 (SD = 0,186).
Dengan demikian didapatkan bahwa nilai TGFβ-1 pada kelompok yang terpapar Mg ECAP terdapat perbedaan yang bermakna dibandingkan kelompok kontrol.
5.2 Hasil Ekspresi BMP-2 pada Kultur Osteoblas Setelah Ditambahkan Dengan Mg ECAP Terhadap Kontrol Dalam Waktu 1 hari, 3 hari, 7 hari dan 14 hari
Berdasarkan perhitungan uji normalitas menggunakan uji Shapiro-Wilk terhadap variabel BMP-2 didapatkan nilai p > 0,05 yang berarti distribusi dari data ini normal.
Uji kemaknaan terhadap nilai ekspresi BMP-2 menggunakan uji t-test tidak berpasangan. Apabila nilai p < 0,05 dinyatakan terdapat perbedaan yang bermakna antara dua variabel yang diuji sedangkan nilai p > 0,05 berarti tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara dua variabel yang diuji.
Tabel 5.2. Perbandingan nilai ekspresi BMP-2 pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
Hari ke-1 31,219±0,118 32,469±0,222 0,001 Hari ke-3 32,667±0,185 33,819±0,213 0,02 Hari ke-7 32,242±0,153 33,415±0,100 0,000 Hari ke-14 32,211±0,244 34,689±0,312 0,000
Hasil uji kemaknaan pada tabel 5.2 menunjukkan bahwa ada perbedaan bermakna (p < 0,05) antara kelompok kontrol osteoblas MG63 tanpa perlakuan dan kelompok sel osteoblas MG63 dengan perlakuan Mg ECAP, dimana pada hari ke-1, secara deskriptif ekspresi BMP-2 pada kelompok dengan perlakuan Mg ECAP lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol. Rerata ekspresi BMP-2 pada biakan sel osteoblas MG63 kelompok perlakuan 32,469 (SD = 0,222) dan kelompok kontrol 31,219 (SD = 0,118). Hari ke-3 setelah perlakuan, terlihat ekspresi BMP-2 pada kelompok perlakuan terjadi peningkatan dengan nilai rerata sebagai berikut: perlakuan 33,819 (SD = 0,213) .dan kontrol 32,667 (SD = 0,185).
Ekspresi BMP-2 pada biakan sel osteoblas MG63 7 hari setelah perlakuan menunjukkan penurunan dimana rerata ekspresi BMP-2 kelompok perlakuan 33,415 (SD = 0,100) dan kelompok kontrol 32,242 (SD = 0,153). Serta pada hari ke-14 didapatkan perningkatan dimana rerata kelompok perlakuan sebesar 34,689 (SD = 0,312) dan kelompok kontrol 32,211 (SD = 0,244).
Dengan demikian didapatkan bahwa nilai BMP-2 pada kelompok yang terpapar Mg ECAP berbeda bermakna dibandingkan kelompok kontrol.
5.3. Biakan Sel Osteoblas MG63
Kontrol Perlakuan
Hari ke-1
KONTROL
KONTROL PERLAKUANPERLAKUAN
Hari ke-3
KONTROL
KONTROL PERLAKUANPERLAKUAN
Hari ke-7
KONTROL
KONTROL PERLAKUANPERLAKUAN
Hari ke-14
KONTROL
KONTROL PERLAKUANPERLAKUAN
Gambar 5.1. Biakan Sel Osteoblas kontrol dan perlakuan pada hari ke-1, 3, 7 dan 14
BAB VI PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa nilai ekspresi gen BMP-2 dan TGFβ-1 yang diisolasi dari biakan .osteoblas MG63 dengan diberikan pajanan berupa Mg ECAP. Jumlah sampel yang diteliti adalah 24 buah untuk masing-masing gen.
Biakan sel osteoblas MG63 sebelumnya dipersiapkan hingga mencapai suatu keadaan konfluen. Pada tahap ini tampak bahwa morfologi dari biakan sel hampir serupa dengan jaringan asalnya. Setelah itu osteoblas akan dipanen, kemudian dihitung jumlah selnya untuk disebar sebanyak 100.000 sel/μl per well dimana sebelumnya telah diisi oleh media kultur. Selanjutnya kelompok perlakuan ditambahkan Mg ECAP sesuai dengan .konsentrasi yang telah ditentukan.
Sementara itu pada kelompok kontrol hanya terdiri dari medium DMEM dan osteoblas, tidak diberikan perlakuan apapun. Setelah itu, sesuai dengan waktu yang telah ditentukan yaitu 1 hari, 3 hari, 7 hari dan 14 hari, tiap well diambil supernatannya sebanyak 200μl untuk menentukan konsentrasi TGFβ-1 dan konsentrasi BMP-2 serta diukur dengan menggunakan teknik Real-Time PCR dan menggunakan primer spesifik berupa Taqman Gene Expression Assay, Gene:
BMP2 (Applied Biosystems Hs00154192_m1) dan Taqman Gene Expression Assay, Gene: TGFβ1 (Applied Biosystems Hs00998133_m1), yang mana teknik ini memiliki keuntungan berupa tingkat sensitifitas dan spesifisitasnya tinggi disertai dengan perhitungannya yang .cepat dan efektif. Selain itu, dengan menggunakan primer yang spesifik akan menghasilkan metode yang akurat dan sensitif untuk identifikasi dan kuantifikasi gen yang dituju dari sampel penelitian.37
Penyembuhan pada fraktur tulang tersusun atas berbagai tingkatan pada tahapan selular yang mana sel-sel mesenkim berespon terhadap berbagai pengatur yang berfungsi dalam diferensiasi, proliferasi dan sintesis matriks ekstraseluler.
Dalam hal ini growth factor ikut serta .dalam pengaturan ini. Matriks tulang merupakan salah satu sumber dari growth factor ini dalam pembentukan tulang.
TGFβ superfamily memiliki aktivitas yang luas selama masa tumbuh kembang,
dan penyembuhan fraktur tulang. BMP-2 .dan TGFβ-1 merupakan salah satu dari TGFβ superfamily ini.
Dengan mengevaluasi ekspresi TGFβ-1 dan BMP-2 selama 14 hari pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan Mg ECAP, diharapkan dapat memperoleh gambaran tentang pola .ekspresi kedua gen tersebut dalam hubungannya dengan fase pembentukan tulang dilihat dari biakan sel osteoblas MG63.
Pada proses pembentukan tulang, peran TGFβ-1 adalah sebagai perangsang proliferasi sel osteoblas, serta perilaku osteoblas itu sendiri sangatlah penting untuk diketahui guna melihat efek biologis dan pengaruh penambahan Mg ECAP.
Pada tabel 5.1, memberikan gambaran .ekspresi TGF β1 dalam hari ke-1. Terlihat ekspresi TGFβ-1 tinggi pada kelompok perlakuan. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan Mg ECAP meningkatkan konsentrasi TGF β1 sejak 24 jam pertama, lebih tinggi jika dibandingkan kelompok kontrol. Hasil ini sesuai dengan penelitian Bonewald dkk yang .menyatakan bahwa pemberian Mg pada osseointegrated implant dapat merangsang terlepasnya growth factor.20
Selanjutnya, pada penelitian ini akan diamati, besar konsentrasi TGF β1 berdasarkan waktu yaitu hari ke-1, .hari ke-3, hari ke-7 dan hari ke-14 dari kedua kelompok. Pada tabel 5.1 dan gambar 5.5 secara deskriptif menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol bahwa dari 24 jam pertama juga menunjukkan adanya peningkatan pada hari ke-3, 7 dan 14. Beberapa peneliti terdahulu juga menyatakan bahwa Mg akan melepaskan secara perlahan-lahan growth factor dan matriks glycoprotein ≥7 hari.22,23,24
BMP-2 merupakan pengatur utama dalam morfogenesis tulang dan beberapa sistem organ pada masa tumbuh .kembang janin. Peranannya didalam pembentukan tulang sangatlah jelas dan kemampuannya sebagai agen osteoinduktif telah banyak diteliti baik itu in vitro maupun in vivo.38
Dari ekspresi dan kuantifikasi BMP-2 selama 14 hari dengan membandingkan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan Mg ECAP, terlihat pola ekspresi BMP-2 dalam hubungannya pada fase .pembentukan tulang. Ekspresi BMP-2
pada sediaan dengan perlakuan di hari ke-1 terlihat lebih tinggi daripada kelompok kontrol. Dan meningkat pada hari ke-3, 7 dan 14 baik itu pada kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan. Namun di hari ke-7, ekspresi BMP-2 baik itu pada kelompok kontrol .maupun kelompok perlakuan tampak menurun. Dan pada hari ke-14 tampak terjadi peningkatan kembali pada kedua kelompok tersebut. Hal ini memperlihatkan bahwa ekspresi BMP-2 pada biakan sel osteoblas ini meningkat setelah pemajanan Mg ECAP sehingga sel-sel ini dapat memiliki kemampuan untuk berdiferensiasi dan merangsang terbentuknya tulang. Pada hari ke-7 terlihat bahwa .ekspresi BMP-2 pada kedua kelompok menurun, yang mana bahwa logam Mg dapat menekan proses inflamasi pada hari ke-7, sehingga ekspresi BMP-2 tampak menurun.
Hal ini sesuai dengan berbagai penelitian-penelitian sebelumnya baik itu in vitro maupun in vivo yang menyatakan bahwa TGFβ-1 dan BMP-2 dapat merangsang sel-sel prekursor mesenkimal .untuk berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel-sel yang membentuk tulang dan kartilago, hal ini menandakan bahwa kedua gen tersebut memainkan peranan penting dalam proses osteogenesis.18,20,22 Penemuan utama dari penelitian awal ini adalah bahwa biakan sel osteoblas MG63 ternyata memproduksi TGFβ-1 dan .BMP-2. Ekspresi TGFβ-1 dan BMP-2 langsung terlihat saat amplifikasi Real-Time PCR dari total mRNA pada biakan sel osteoblas MG63, dimana nilai ekspresi TGFβ-1 dan BMP-2 pada biakan sel osteoblas MG63 yang dipajankan dengan Mg ECAP cenderung lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrolnya.
Magnesium merupakan salah satu mineral yang terdapat didalam tubuh manusia dan esensial dalam osteogenesis dan remodelling tulang. Penggunaan Mg sebagai material plate dan screw cukup baik .karena sifat kompatibilitasnya, dapat diresorbsi oleh tubuh manusia dan menstimulasi pertumbuhan tulang. Pada penelitian yang dilakukan oleh Cho dkk (2010), respon tulang tibia kelinci terhadap implant Mg memperlihatkan tingkat osteokonduktivitas yang tinggi.39 Hal ini dapat mendukung terjadinya penyembuhan tulang awal, sehingga dapat dilakukan mobilisasi lebih cepat dengan tingkat penyembuhan yang cepat pula, yang mana hal ini sangat menguntungkan bagi pasien.
BAB VII
KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
Dilihat dari penelitian diatas, terlihat adanya perbedaan ekspresi TGFβ-1 pada biakan sel osteoblas MG63 baik itu .kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan. Pada hari ke-1, 3, 7 dan 14 terjadi proliferasi osteoblas yang ditingkatkan dengan pemajanan Mg ECAP.
Terlihat juga perbedaan ekspresi BMP-2 pada biakan sel osteoblas MG63 pada kelompok kontrol dan perlakuan. Pada .hari ke-7, terjadi penurunan ekspresi BMP-2, yang mana Mg dapat menekan proses inflamasi sehingga ekspresi BMP-2 menjadi rendah, dan pada hari ke-14 kembali meningkat, Hal ini memperlihatkan sel-sel ini dapat memiliki kemampuan untuk berdiferensiasi dan merangsang terbentuknya tulang.
Logam Mg memiliki sifat yang menguntungkan apabila bahan logam tersebut dapat digunakan sebagai bahan .biomaterial pada kasus fraktur oral dan maksilofasial. Penggunaan Mg sebagai material plate dan screw cukup baik karena dapat diresorbsi oleh tubuh manusia dan menstimulasi pertumbuhan tulang.
7.2 Saran
Penelitian selanjutnya perlu dilakukan agar dapat mengetahui sifat-sifat dari bahan ini. Diharapkan dengan penelitian .lanjutan ini akan dapat menjelaskan lebih lanjut proses pembentukan tulang pada daerah fraktur dan hubungannya dalam sifat perjalanan sinyal dari Mg ECAP terhadap growth factor dan pengaruhnya dalam osteogenesis secara lebih mendalam.
DAFTAR PUSTAKA
1. Buchbinder D. Treatment of fractures of the edentulous mandible, 1943 to 1993: a review of the literature. J Oral Maxillofacial Surg 1993;
51(11):1174-80.
2. Haerle F, Champy M, Terry B. Atlas of Craniomaxillofacial Osteosynthesis. 2e edition. 2009. Thieme; Stuttgart, New York.
3. Bowers DG, Jr., Lynch JB. Management of facial fractures. South Med J 1977;70(8):910-8.
4. Steinhauser EW. Historical development of orthognatic surgery. J Craniomaxillofac Surg 1996;24(4):195-204.
5. Ehrenfeld M, Manson PN, Prein J. Principles of Internal Fixation of the Craniomaxillofacial Skeleton Trauma and Orthognathic Surgery. AO Foundation. 2012. Thieme; Stuttgart, New York.
6. Kellman Robert M, Marentette L. Atlas of Craniomaxillofacial Fixation.
1995. Raven Press, Ltd; New York.
7. Bhatt V, Langford RJ. Removal of miniplates in maxillofacial surgery:
University Birmingham experience. J Oral Maxillofacial Surg 2003;61(5):553-6.
8. Bhatt V, Chhabra P, Dover MS. Removal of miniplates in maxillofacial surgery: a follow-up study. J Oral Maxillofacial Surg 2005;63(6):756-60.
9. Matthew IR, Frame JW. Policy of consultant oral and maxillofacial surgeons towards removal of miniplate components after jaw fracture fixation: pilot study. Br J Oral Maxillofacial Surg 1999;37(2):110-2.
10. Mordike BL, Ebert T. Magnesium: Properties-applications-potential.
Materials Sci Eng A 302. 2001:37-45.
11. Witte F, Kaese V, Haferkamp H, Switzer E, Meyer-Lindenberg A, Wirth J, Windhagen H. In vivo corrosion of four magnesium alloys and the associated bone response. Biomaterials 2005;26(17):3557-63.
12. Staiger PM, Pietak MA, Huadmai J. Magnesium and its alloys as orthopedic biomaterials: A review. Biomaterials 2006;27:1728-1734.
13. Zreiqat H, Howlet CR, Zannettino A, Evans P, Schulze-Tanzil G, Knabe C, Shakibaei M. Mechanisms of magnesium-stimulated adhesion of
osteoblastic cells to commonly used orthopaedic implants. Biomed Mat Res 2002;62(2):175-184.
14. Salis EL, Mervaala E, Karppanen H, Khawaja JA, Lewenstam A.
Magnesium: An update on physiologic, clinical and analytical aspects.
Clin Chim Acta 2000;294:1-26.
15. Valiev RZ, Langdon TG. Principles of equal-channel angular pressing as a processing tool for grain refinement. Progress in Materials Science 2006;51(7):881-981.
16. Karayan AI, Pratesa Y, Ashari A, Fadli E, Nurjaya DM. Corrosion resistance improvement of ECAP-Processed pure magnesium in ringer's solution. Thesis 2011. Department of Metalurgy Engineering, University of Indonesia, Jakarta, Indonesia.
17. Nur Aini. Karakteristik biokompatibilitas dan analisis logam berat magnesium yang telah melalui proses equal channel angular pressing (ECAP) secara in vitro. Thesis 2013. Dept. Oral Max Surg., Faculty of Dentistry, University of Indonesia, Jakarta, Indonesia.
18. Colnot C. Cellular and molecular interactions regulating skeletogenesis.
Journal of Cellular Biochemistry 2005;95(4):688-97.
19. Giannoudis PV, Einhorn TA, Marsh D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. Int. J. Care Injured 2007;38S4:S3-6.
20. Giannoudis PV, Upadhyay N, Tsiridis E. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. Int. J. Care Injured 2007;38S1:S11-S25.
21. Pfeilschifter J, Wolf O, Nautmann A, Minne H.W., Mundy GR, Ziegler R.
Chemotactic response of osteoblastlike cells to TGFβ. J. Bone. Miner.
Res. 1990;5:825-830.
22. Bonewald LF, Mundy GR. Role of transforming growth factor-beta in bone remodelling. Clin. Orthop. Relat. Res. 1990;250:261-276.
23. Cho TJ, Gerstenfeld LC, Einhorn TA. Differential temporal expression of members of the transforming growth factor beta superfamily during murine fracture healing. J Bone Miner Res. 2002;17:513−520.
24. Hughes FJ, Turner W, Belibasakis G, Martuscelli G. Effects of growth factors and cytokines on osteoblast differentiation. Periodontology 2000;41(6):48–72.
25. Goldstein JA. The use of bioresorbable material in craniofacial surgery.
Clin Plast Surg 2001;28(4):653-9.
26. Hasirci V, Lewandrowski KU, Bondre SP, Gresser JD, Trantolo DJ, Wise DL. High strength bioresorbable bone plates : preparation, mechanical properties and in vitro analysis. Biomed Mater Eng 2000;10(1):19-29.
27. Boretos JW, Eden M. Contemporary Biomaterials, Material and Host Response, Clinical Applications, New Technology and Legal Aspects.
Noyes Publications, Park Ridge, NJ (1984). pp. 232-233.
28. Williams DF, Cunningham J. Materials in Clinical Dentistry. Oxford, UK;
Oxford University Press, 1979.
29. Park JB. Biomaterials Science and Engineering. New York; Plenum Press, 1984.
30. Patel NR, Gohil PP. A review on biomaterials: scope, applications &
human anatomy significance. IJETAE 2012;2(4):91-101.
31. Witte F. The history of biodegradable magnesium implants: A review.
Acta Biomaterialia 2010;6(5):1680-92.
32. Adedokun ST. A review on equal channel extrusion as a deformation and grain refinement process. JETEAS 2011;2(2):360-63.
33. Franceschi RT, Yang S, Rutherford RB, Krebsbach PH, Zhao M, Wang D.
Gene therapy approaches for bone regeneration. Cells. Tissues. Organs.
2004;176:95-108.
34. Kempen DHR, Creemers LB, Alblas J, Lu L, Verbout AJ, Yaszemski MJ, Dhert WJA. Growth factor interactions in bone regeneration. Tissue Eng 2010;16(6):551-566.
35. Kingsley DM. The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes Dev.
1994;8(2):133-46.
36. Lieberman JR, Daluiski A, Einhorn TA. The role of growth factors in the repair of bone. J Bone Joint Surg 2010;84A(6):1032-1044.
37. Bartlett JMS, Stirling D. A short history of the polymerase chain reaction.
PCR Protocols 2003;226:3-6.
38. Shin JH, Kim DG, Park CJ, Cho LR, Lee HS, Byon ES, Jeong YS. Initial response of osteoblast-like cells on magnesium ion implanted titanium surface. Tiss Eng Regen Med 2010;7(3):330-337.
39. Cho LR, Kim DG, Kim JH. Bone response of Mg ion implanted clinical implants with plasma source ion implantation method, Clin Oral Impl Res 2010.
40. Sakou T. Bone morphogenetic proteins: from basic studies to clinical approaches. Bone 1998; 22(6):591–603.
41. Kim MK, Niyibizi C. Interaction of TGFβ-1 and rhBMP-2 on human bone marrow stromal cells cultured in collagen gel matrix. Yonsei Med J 2001;
42(3):338-344.
42. Gazzerro E, Gangji V, Canalis E. Bone morphogenetic proteins induce the expression of noggin, which limits their activity in cultured rat osteoblast.
J Clin Invest 1998;102:2106-14.
Lampiran 1
Kurva hasil kuantifikasi Real‐Time PCR
Kelompok TGFβ‐1
Lampiran 2
Kelompok BMP‐2
Lampiran 3
nilai ekspresi TGFB1 .187 24 .030 .930 24 .095
a Lilliefors Significance Correction
Hari ke‐1
Group Statistics
kelompok N Mean Std. Deviation
Std. Error Mean
nilai ekspresi TGFB1 kontrol hari 1 3 22.1742 .05504 .03178
perlakuan hari 1 3 25.1720 .16565 .09564
Independent Samples Test
4.912 .091 -29.746 4 .000 -2.99780 .10078 -3.27761 -2.71799
-29.746 2.436 .000 -2.99780 .10078 -3.36488 -2.63072
Equal variances t-test for Equality of Means
Lampiran 4
Hari ke‐3
Group Statistics
kelompok N Mean Std. Deviation
Std. Error Mean
nilai ekspresi TGFB1 kontrol hari 3 3 25.2027 .56499 .32620
perlakuan hari 3 3 27.9736 .03729 .02153
Hari ke‐7
Group Statistics
kelompok N Mean Std. Deviation
Std. Error Mean
nilai ekspresi TGFB1 kontrol hari 7 3 26.2452 .08135 .04697
perlakuan hari 7 3 27.9934 .65666 .37912
12.859 .023 -8.476 4 .001 -2.77082 .32691 -3.67846 -1.86318 -8.476 2.017 .013 -2.77082 .32691 -4.16582 -1.37583 Equal variance t-test for Equality of Means
Lampiran 5 Hari ke‐7
Group Statistics
kelompok N Mean Std. Deviation
Std. Error Mean
nilai ekspresi TGFB1 kontrol hari 14 3 27.7400 .18631 .10756
perlakuan hari 14 3 29.4348 .67802 .39146
Hari ke‐14
3.597 .131 -4.175 4 .014 -1.69483 .40597 2.82197 -.56768
-4.175 2.300 .041 -1.69483 .40597 3.24024 -.14941 Equal varianc t-test for Equality of Means
Independent Samples Test
11.613 .027 -4.576 4 .010 -1.74825 .38202 2.80891 -.68759
-4.576 2.061 .042 -1.74825 .38202 3.34593 -.15057 Equal varianc t-test for Equality of Means
Lampiran 6 Analisa Data BMP‐2
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic Df Sig.
nilai ekspresi BMP2 .190 24 .026 .923 24 .069
a. Lilliefors Significance Correction
Hari ke‐1
Independent Samples Test
Levene's Test
for Equality of
Variances t-test for Equality of Means
Variances t-test for Equality of Means
Difference Lower Upper
nilai
3.928 .002 -1.15174 .16298 -1.60754
Variances t-test for Equality of Means
Difference Lower Upper
nilai
4 .000 -2.17354 .10577 -2.46721 -1.87987
Equal
3.465 .000 -2.17354 .10577 -2.48599 -1.86110
Variances t-test for Equality of Means
Difference Lower Upper
nilai
4 .000 -2.47888 .22887 -3.11431 -1.84344
Equal
3.784 .001 -2.47888 .22887 -3.12887 -1.82888