Kultivar nenas dikelompokkan dalam 5 grup yaitu Cayenne, Queen, Spanish, Pernambuco (Abacaxi) dan Perolera (Maipure) (Petty et al. 2002). Kultivar yang banyak ditanam di Indonesia adalah Cayenne dan Queen. Kultivar Queen mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan kultivar Cayenne yaitu warna kulit dan daging buah menarik, tidak berserat, rasa dan aroma banyak disukai, lebih tahan terhadap penyakit (Purseglove, 1972). Kekurangannya adalah daunnya berduri sehingga agak sulit dalam pengelolaan, ukuran buah lebih kecil, mata pada buah lebih dalam sehingga banyak bagian yang terbuang ketika dikupas.
Pada dasarnya ada 3 macam teknik perbanyakan mikro yaitu: (1) perbanyakan meristem adventif (organogenesis), (2) embriogenesis somatik dan (3) perbanyakan tunas aksilar (tunas yang sudah ada di meristem) (Fiorino dan Loreti, 1987; Rice et al. 1992). Metode lain yang merupakan modifikasi dari perbanyakan meristem adventif adalah teknik kultur kalus nodular. Nodular adalah kumpulan sel yang menunjukkan pola diferensiasi jaringan dan sel internal yang konsisten. Nodular dapat diinduksi dari kalus atau secara langsung dari eksplan. Nodular nenas mempunyai karakter yang sama dengan kalus yaitu dapat berproliferasi membentuk nodular baru dan regenerasi menjadi tunas (Teng, 1997).
Manipulasi sel, jaringan dan organ tanaman dalam kultur in vitro untuk tujuan perbanyakan dan modifikasi tanaman sangat bergantung pada penggunaan
ZPT. BAP sering digunakan dalam perbanyakan in vitro untuk mendapatkan
multiplikasi yang tinggi karena harganya lebih murah dibanding zeatin dan TDZ. Penggunaan sitokinin dan ZPT lainnya dalam konsentrasi tinggi meningkatkan frekuensi tanaman regeneran tumbuh abnormal. Perbanyakan nenas kultivar Queen klon Bogor pada media MS + 1 mg/l BAP menghasilkan 9 tunas selama 2 bulan bila konsentrasi BAP ditingkatkan menjadi 2 mg/l jumlah tunas menjadi 2 (Imelda dan Erlyandari, 2000). Prahardini et al. (1995) dengan menambahkan
8 mg/l BA dan 0,5 mg/l GA3 pada media MS mendapatkan 9 tunas in vitro nenas kultivar Queen klon Blitar pada umur 5 bulan. Kedua penelitian diamati hanya pada subkultur (SK) 1.
Subkultur dilakukan untuk meningkatkan kecepatan multiplikasi. Fiorino dan Loreti (1987) menyatakan jumlah tunas baru yang terbentuk dari 1 eksplan meningkat sampai SK ketiga atau keempat kemudian stabil. Frekuensi SK yang berlebihan dapat menginduksi variasi (Skirvin et al. 1994). Secara teori, subkultur dapat dilakukan terus menerus tetapi dengan bertambahnya umur kultur, maka SK menjadi kurang responsif dan muncul ketidakstabilan genetik (variasi somaklonal). Oleh karena itu untuk mempertahankan tanaman true to type jumlah subkultur harus dibatasi. Pada pisang SK maksimal 10 kali (Cote et al. 1993).
Variasi somaklonal tanaman ditentukan oleh faktor genetik dan epigenetik (Larkin dan Scorwcorft, 1981; Kaeppler et al. 2000). Variasi genetik dalam kultur in vitro terutama terlihat pada variasi sitologi meliputi perubahan ploidi dan patah kromosom, mutasi gen tunggal meliputi perubahan basa dan aktifasi atau inaktifasi gen. Variasi epigenetik adalah perubahan ekspresi gen yang dapat diturunkan secara somatik atau meitotik tetapi berpotensi dapat kembali normal (dapat balik) dan tidak menyebabkan modifikasi sekuen DNA (Kaeppler et al.
2000). Contoh variasi epigenetik adalah tanaman padi mutan kerdil diperlakukan dengan inhibitor metilasi DNA (5-deoxyozacytidine) kembali menjadi tanaman normal (Oono, 1985 dalam Kaeppler et al. 2000). Variasi somaklonal dapat dilihat dengan adanya ketidaknormalan sitologi, frekuensi mutasi feno tipe, perubahan sekuen DNA dan aktifasi dan silencing gen (Kaeppler et al. 2000).
Untuk mengevaluasi variasi somaklonal dengan baik diperlukan beberapa pendekatan yaitu melalui pengamatan karakter morfologi, sitologi dan molekuler karena penggunaan marker molekuler saja tidak efisien. Banyak teknik molekuler telah dikembangkan untuk menilai keragaman genetik, diantaranya analisis isozim dan RAPD. Dengan mengkombinasikan pengamatan karakter morfologi dan molekuler maka kelemahan masing- masing karakter dapat dieliminasi sehingga didapatkan hasil evaluasi variasi yang akurat. Isozim tidak dapat digunakan untuk membedakan antar kultivar Citrus (Roose, 1988) sedangkan Deng et al. (1995) dengan menggunakan RAPD dapat membedakan tanaman lemon mutan dengan
tanaman normal. Pada tanaman bit gula, analisis RAPD dengan 5 primer terhadap 120 tanaman regeneran dari tunas adventif in vitro dari eksplan daun genotipe tunggal bit gula didapatkan variasi 3 dari 5 607 pita (0,05%) (Munthali et al. 1996). Sementara Shoyama et al. (1997) melaporkan produk amplifikasi dengan
21 primer menunjukkan pita monomorfik pada seluruh plantlet Panax
notoginseng (17 tanaman) yang diregenerasi melalui embriogenesis dan tanaman asal. Tujuan penelitian adalah:
1 Mempelajari pengaruh BAP SK 1 terhadap multiplikasi, kualitas buah dan kestabilan genetik tanaman regeneran berdasarkan karakter morfologi, isozim dan RAPD
2 Mempelajari pengaruh BAP SK 2 terhadap multiplikasi dan kestabilan genetik tanaman regeneran berdasarkan karakter morfologi dan RAPD
3 Mempelajari pengaruh BAP SK 3 terhadap multiplikasi dan kestabilan genetik tanaman regeneran berdasarkan karakter morfologi dan RAPD
4.2. Bahan dan Metode 4.2.1. Bahan Tanam
Bahan tanam yang digunakan adalah mahkota buah nenas kultivar Queen klon Bogor yang sudah masak (1/3 bagian buah berwarna kuning). Buah nenas berasal dari kebun petani di Ciapus Bogor.
4.2.2. Metode Penelitian
Penelitian terdiri atas beberapa tahap dimulai dari perbanyakan in vitro
tanaman nenas di Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB, aklimatisasi dan penanaman bibit hasil perbanyakan in vitro di Kebun Percobaan Tajur. Penelitian dimulai Juli 2002 sampai Maret 2005. Pengamatan yang dilakukan pada plantlet di laboratorium adalah pengamatan morfologi dan anatomi. Pengamatan yang dilakukan pada tanaman di lapangan adalah pengamatan morfologi fase vegetatif, generatif dan mutu buah. Pada tanaman di lapangan juga dilakukan analisis isozim di Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB dan analisis RAPD di Laboratorium Molekuler Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB. Penelitian terdiri atas 3 percobaan yaitu:
1 Pengaruh BAP SK 1 terhadap multiplikasi, kualitas buah dan kestabilan genetik tanaman regeneran berdasarkan karakter morfologi, isozim dan RAPD
2 Pengaruh BAP SK 2 terhadap multiplikasi dan kestabilan genetik tanaman regeneran berdasarkan karakter morfologi dan RAPD
3 Pengaruh BAP SK 3 terhadap multiplikasi dan kestabilan genetik tanaman regeneran berdasarkan karakter morfologi dan RAPD
Keterkaitan diantara 3 percobaan di atas dapat dilihat pada Gambar 17.
SK 1
Pengakaran Aklimatisasi Lapangan SK 2
SK 3
Gambar 17 Alur kegiatan perbanyakan in vitro nenas kultivar Queen
4.2.3. Pengaruh BAP SK 1 terhadap Multiplikasi, Kualitas Buah dan Kestabilan Genetik Tanaman Regeneran Berdasarkan Karakter Morfologi, Isozim dan RAPD
4.2.3.1. Perbanyakan In Vitro Nenas kultivar Queen.
Percobaan menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) dengan satu faktor yaitu konsentrasi BAP: 0; 2,22; 4,44 ; 8,88 dan 17,76 µM.
Media yang digunakan adalah MS+1,61 µM NAA, sedangkan untuk BAP 0 µM
adalah MS tanpa ZPT (MS0). Setiap perlakuan terdiri dari 2 botol dan diulang 20 kali. Ulanga n berdasarkan asal mahkota buah nenas. Sebagai pembanding
Mata tunas aksilar Mahkota buah Media MS0 Media BAP Media BAP Madia BAP Pengamatan: • In vitro • Anatomi • Morfologi • Isozim • RAPD
digunakan media MS0 dan data yang didapat tidak diolah bersama data perlakuan BAP. Bahan tanam yang digunakan adalah tunas dari mata tunas aksilar mahkota yang diinisiasi pada media MS0 umur 4 minggu. Tunas dipotong secara vertikal dan dibelah secara horizontal dan diusahakan bagian pangkalnya tidak terpotong. Tunas ditanam dalam media mengandung BAP sesuai perlakuan selama 11 minggu selanjutnya tunas yang terbentuk separuh ditanam dalam media akar (MS + 0,45 µM NAA) selama 7 minggu dan diaklimatisasi. Separuh tunas sisanya disubkultur ke media BAP untuk percobaan 4.2.4. Aklimatisasi dilakukan dengan mengeluarkan plantlet dari botol kultur, kemudian dicuci untuk menghilangkan agar yang melekat. Selanjutnya plantlet ditanam dalam gelas plastik berisi media campuran pasir dan kompos dengan perbandingan 1:3. Plantlet dipelihara dalam rumah kaca dengan naungan paranet 75% selama 3 bulan kemudian dipindah ke polibag dan diletakkan di tempat terbuka selama 4 bulan.
Peubah yang diamati pada saat in vitro adalah: jumlah tunas dalam media BAP, jumlah tunas, persentase tunas berakar dalam media pengakaran (MA), anatomi plantlet dan pada saat aklimatisasi jumlah plantlet, jumlah akar, panjang akar terpanjang dari 5 plantlet dan macam varian ya ng muncul.
4.2.3.2. Penanaman Tanaman di Lapangan.
Tanaman regeneran ditanam di lapangan untuk diamati kualitas buah dan kestabilan morfologinya. Percobaan menggunakan RKLT dengan satu faktor yaitu konsentrasi BAP: 0; 2,22; 4,44 ; 8,88 dan 17,76 µM. Bibit hasil SK 1 berumur 7 bulan ditanam di lapangan dengan 16 ulangan. Jumlah tanaman contoh yang diamati tiap ulangan adalah 44 tanaman. Total tanaman yang diamati adalah 734 tanaman perlakuan BAP dan 30 tanaman kontrol. Jarak tanam yang digunakan adalah 60 cm x 30 cm dan bibit ditanam 1 tanaman/lubang. Pemupukan dilakukan setiap 3 bulan sebanyak 4 kali dengan dosis total 900 kg/ha Urea, 400 kg/ha TSP dan 900 kg/ha KCl. Pengendalian hama dilakukan dengan pemberian furadan pada saat tanam, dan curacron setiap 3 bulan. Pada umur 11 bulan tanaman hasil perbanyakan SK 1 diinduksi dengan campuran 1 ml/l ethrel dan 20 g/l urea. Campuran tersebut disiramkan pada pucuk tanaman sebanyak 50 ml/tanaman.
Peubah yang diamati pada fase vegetatif dimulai pada umur 12 MST adalah :
1 Tinggi tanaman (cm): diukur dari permukaan tanah sampai ujung daun tertinggi yang ditangkupkan ke atas.
2 Diameter tanaman (cm): diukur dengan mengukur garis tengah tanaman
3 Panjang daun (cm): diukur dari pangkal daun sampai ujung dari daun yang terpanjang
4 Lebar daun (cm): diukur bagian daun terlebar dari daun yang terpanjang
5 Jumlah daun: dihitung banyaknya daun yang ada kecuali 1 lembar daun
yang termuda yaitu daun yang terakhir muncul
6 Tanaman menghasilkan anakan (%):
tanaman yang menghasilkan anakan X 100% jumlah tanaman yang hidup
7 Jumlah anakan: dihitung banyaknya anakan dari tanaman yang menghasilkan anakan
8 Macam dan jumlah variasi yang muncul
Pengamatan pada saat panen dilakukan sebanyak 4 ulangan dengan jumlah tanaman 8-20 tanaman untuk setiap perlakuan. Peubah yang diamati pada fase generatif dan panen adalah:
1 Tanaman berbuah (%) : tanaman yang berbuah X 100 % tanaman yang hidup
2 Jumlah anakan: anakan dihitung secara terpisah antara tunas anakan (sucker), tunas samping (shoot), tunas tangkai buah (slip) per tanaman 3 Jumlah daun: daun yang masih berwarna hijau ketika buah dipanen
4 Bobot mahkota (g): mahkota dilepas dari buah dan ditimbang
5 Bobot buah (g): buah tanpa mahkota ditimbang
6 Panjang buah (cm): diukur dari bagian pangkal buah sampai ujung setelah dibuang mahkotanya
7 Panjang mahkota (cm): diukur dari bagian pangkal mahkota sampai ujung daun mahkota
8 Panjang tangkai buah (cm): diukur dari pangkal buah sampai daun bendera
9 Diameter tangkai buah (cm): diukur pada bagian tengah dari tangkai buah
10 Diameter buah (cm): diukur keliling buah selanjutnya dikonversi menjadi diameter buah
11 Diameter hati (cm): diukur pada bagian tengah hati dari buah yang telah dibelah horizontal
12 Tebal daging buah (cm): diukur pada bagian tengah buah dari buah yang telah dibelah horizontal
13 Kedalaman mata (cm): diukur di tiga tempat dari buah yang telah dibelah horizontal
14 pH buah: buah diperas dan cairannya diukur dengan pH meter
15 Padatan Terlarut Total: cairan buah diteteskan pada refraktometer dan dibaca nilainya (Brix)
Tingkat kehomogenan data diuji dengan uji Barlet. Data yang diperoleh diuji dengan uji F dan bila berpengaruh nyata pada taraf 5% dilakukan uji lanjut dengan duncan multiple range test (DMRT).
4.2.3.3. Analisis Isozim
Langkah kerja dalam analisis isozim meliputi pembuatan larutan penyangga (buffer), pembuatan gel, ekstraksi enzim, running dan pewarnaan. Larutan penyangga ada 2 macam yaitu penyangga gel dan penyangga elektroda (Tabel 9). Penyangga elektroda bisa dipakai maksimal 3 kali elektroforesis.
Pembuatan gel pati. Sebelum digunakan cetakan gel diolesi dengan parafin cair untuk mempermudah melepas gel. Pati 10% dan larutan penyangga gel dimasukkan ke labuh didih, selanjutnya labu didih dimasukkan dalam penangas air yang mendidih sambil terus diputar-putar sampai gel matang secara merata (±10 menit). Gel segera divakum selama 10 menit kemudian dituang dalam cetakan dan dibiarkan sampai dingin pada suhu kamar untuk digunakan.
Tabel 9 Bahan-bahan kimia larutan penyangga dalam analisis isozim
Penyangga Bahan Jumlah
Gel L-histidin pH 6 5 mM
Elektroda Asam sitrat monohidrat 50 mM
Tris pH 6 150 mM
Ekstraksi Tris-HCl buffer pH 7,5 7,5 mM
sukrosa (w/v) 5%
PVP-40 (w/v) 5%
merkaptoetanol (0,1% v/v) 14 mM
asam askorbat 50 mM
dietilditiokarbamat 10 mM
bovine serum albumin. 0,1%
Ekstraksi enzim. Masing- masing perlakuan diambil 4 tanaman hasil perbanyakan in vitro dan dieskstraksi secara terpisah. Pada saat analisis dilakukan dengan mencampur 4 ekstrak enzim dari masing- masing perlakuan. Analisis isozim hanya pada populasi tanaman hasil SK 1. Bahan yang dianalisis adalah daun ke-4 dari tanaman nenas berumur 11 bulan setelah ditanam di lapangan, bagian pangkal daun yang berwarna putih dipotong, dicuci dan dimasukkan ke dalam plastik. Sampel dibawa ke laboratorium dengan termos es berisi es batu untuk menjaga kesegarannya. Daun sebanyak 0,8-1,0 g dipotong kecil-kecil dimasukkan ke dalam mortal yang dikelilingi es batu, kemudian ditambahkan 1,2 ml buffer ekstrak moderat (Tabel 9). Sampel digerus sampai halus dan dimasukkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml, selanjutnya disentrifuse selama 10 menit pada suhu 5 oC pada 12 000 rpm. Supernatan diambil dengan
pipet mikro dan dimasukkan ke dalam tabung ependorf dan disimpan dalam
freezer.
Elektroforesis sampel. Kertas saring dengan ukuran sesuai sumur dicelupkan ke ekstrak sampel dan diselipkan ke sumur gel dan sebagai kontrol mobilitas elektroforesis digunakan bromfenol biru. Gel ditutup dengan plastik dan selanjunya dielektroforesis selama 5 jam dengan kuat arus konstan sebesar 18 mA.
Pewarnaan. Kertas saring yang ada di sumur dibuang dan gel diiris secara horizontal menjadi 2 potongan untuk pewarnaan 2 macam enzim. Larutan
pewarna untuk isozim tertentu bersifat spesifik dan harus baru. Metode pewarnaan mengikuti metode Wendel dan Weeden (1989), sedangkan bahan-bahan yang digunakan tercantum pada Lampiran 4. Sistem enzim yang dianalisis adalah peroksidase (PER), malat dehidrogenase (MDH), alkohol dehidrogenase (ADH), aspartat aminotransferase (AAT), esterase (EST), asam fosfatase (ACP).
4.2.3.4. Analisis RAPD
Isolasi DNA. Isolasi DNA menggunakan metode CTAB Doyle dan Doyle (1987). Bahan yang dianalisis adalah daun ke 4 dari tanaman hasil perbanyakan
in vitro (Gambar 18) diambil bagian pangkalnya sebanyak 0,5 g dan dipotong
A B
Gambar 18 Daun tanaman normal (A) dan daun tanaman variegata (B) untuk analisis RAPD dan isozim
kecil-kecil. Tanaman hasil SK 1 berumur 10 bulan setelah tanam di lapangan, SK 2 berumur 3 bulan dan SK 3 berumur 8 bulan. Masing- masing perlakuan terdiri dari 4 tanaman. Potongan daun dimasukkan ke mortal, lalu ditambah PVPP dan nitrogen cair dan d igerus sampai halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah berisi 600 µl larutan buffer ekstrak CTAB (2% w/v CTAB, 1 M Tris-HCl pH 8, 0,5 M EDTA pH 8, 5 M NaCl dan 1% v/v mercaptoethanol), campuran dikocok kemudiandipanaskan dalam pemanas air selama 30 menit pada suhu 65 oC. Campuran dibiarkan hingga mencapai suhu kamar lalu ditambahkan 600 µl larutan kloroform : isoamilalkohol (24:1) dan dikocok. Campuran disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Supernatan dipipet ke dalam tabung baru dan ditambahkan isopropanol dingin
semalam. Camp uran dicairkan pada suhu kamar dan disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Cairan dibuang dengan hati- hati dan pellet ditambah etanol 70% dingin sebanyak 100 µl dan disentrifuse selama 5 menit dengan 12 000 rpm. Cairan dibuang dan pellet dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Pellet yang telah kering ditambahkan 100 µl air bebas ion dan dikocok hingga larut.
Pemurnian DNA. Pemurnian DNA menggunakan metode Sambrook
et al. (1989). Larutan DNA ditambah 1 µl RNAase dan dibiarkan pada suhu kamar selama 2 jam, lalu ditambahkan fenol kloroform isoamilalkohol dingin sebanyak 100 µl dan disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Supernatan dipipet ke dalam tabung baru dan ditambahkan kloroform isoamilalkohol dengan volume yang sama, selanjutnya disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Supernatan dipipet ke dalam tabung baru kemudian ditambahkan natrium asetat 3 M pH 5,2 sebanyak 1/10 volume dan isopropanol dingin sebanyak 2,5 volume. Larutan dikocok hingga homogen dan disimpan dalam freezer 60 menit atau semalam. Larutan disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm, pellet yang diperoleh ditambah etanol 70% sebanyak 100 µl dan disentrifuse selama 5 menit dengan 12 000 rpm. Cairan dibuang dan pellet dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Pellet yang telah kering ditambahkan 100 µl air bebas ion dan dikocok hingga larut.
Uji kualitas DNA dengan gel agarose. Gel agarose 0,8% dibuat dengan mencampur 0,32 g agarose dan 40 ml larutan TAE 1x, kemudian dipanaskan sampai mendidih. Larutan dibiarkan agak dingin dan dituang ke dalam cetakan gel yang telah disiapkan posisi sisirnya. Gel dibiarkan memadat selama 1 jam.
Hasil ekstraksi DNA sebanyak 5 µl dicampur dengan 1 µl Loading dye
dimasukkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis dilakukan dengan alat elektroforesis pada 100 volt selama 30 menit. Gel yang telah selesai dieletroforesis direndam dalam larutan ethidium bromida 0,1% dan dibilas dengan air selanjutnya pita DNA dilihat pada UV transiluminator.
Uji kuantitas dengan spektrofotometri. Larutan DNA sebanyak 20 µl dimasukkan ke kuvet dan ditambahkan 1900 µl aquades steril. Larutan diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kepadatan
optik (OD) 260 menunjukkan penyerapan sinar uv oleh nukleotida, sedangkan OD 280 menunjukkan penyerapan sinar uv oleh protein. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio OD 260 terhadap 280 berkisar antara 1,8-2,0 (Sulandari dan Zein, 2003). Konsentrasi DNA untai ganda dihitung dengan menggunakan rumus:
[DNA] (µg/ml) = A260 x 50 x Faktor pengenceran
Amplifikasi RAPD dengan PCR. DNA yang dianalisis merupakan DNA campuran dari 4 tanaman untuk masing- masing perlakuan. Primer yang digunakan adalah OPE 7, OPE 11, OPG 2 dan SBA 8. Campuran bahan PCR sebanyak 25 µl terdiri dari 2 µl (konsentrasi 25 ng), 16,77 µl air bebas ion, 2 µl MgCl2, 2,5 µl
buffer bebas MgCl2, 0,6 µl dNTP, 0,13 µl Tag polimerase, 1 µl primer
dimasukkan ke dalam tabung PCR dan ditambahkan 15 µl mineral oil. Campuran divortek dan dimasukkan ke mesin PCR ASTEC Thermal Cycler PC 707 dengan program sebagai berikut: (inisiasi denaturasi selama 1,5 menit pada suhu 94 oC, amplifikasi 40 siklus masing- masing terdiri dari 0,5 menit pada 94 oC, 1 menit 36 oC, 2 menit pada 72 oC, dan terakhir stop PCR selama 4 menit pada 72 oC). Hasil amplifikasi dilihat dengan elektroforesis. Pelaksanaan elektroforesis hasil PCR sama dengan proses pengujian kualitas DNA, namun konsentrasi gel agarosenya 1,2-1,5% dan perbandingan DNA hasil PCR: Loading dye adalah 10:2. Hasil elektoforesis divisualisasikan di atas uv transluminator dan didokumentasikan dengan kamera dan ditransfer ke disket.
4.2.4. Pengaruh BAP SK 2 terhadap Multiplikasi dan Kestabilan Genetik Tanaman Regeneran Berdasarkan Karakter Morfologi dan RAPD
Percobaan menggunakan RKLT dengan satu faktor yaitu konsentrasi BAP: 0; 2,22; 4,44; 8,88 dan 17,76 µM. Setiap perlakuan terdiri dari 2 botol dan diulang 6 kali. Bahan tanam yang digunakan adalah tunas in vitro yang berasal dari media BAP SK 1 umur 11 minggu. Jumlah tanaman per botol pada setiap perlakuan tidak sama ya itu berkisar antara 7-14 tunas/botol. Plantlet ditanam dalam media BAP SK 2 selama 12 minggu kemudian dipindah ke media akar MS+0,54 µM NAA selama 10 minggu selanjutnya plantlet diaklimatisasi.
Bibit berumur 5,5 bulan ditanam di lapangan dengan 3 ulangan. Jumlah tanaman contoh yang diamati tiap perlakuan adalah 20 tanaman. Rancangan percobaan yang digunakan dan cara penanaman sama seperti pada percobaan 4.2.3. Pengamatan peubah pada saat in vitro dan tanaman di lapangan sama seperti pada percobaan 4.2.3. Karakter morfologi yang diamati di lapangan hanya sampai fase vegetatif.
4.2.5. Pengaruh BAP SK 3 terhadap Multiplikasi dan Kestabilan Genetik Tanaman Regeneran Berdasarkan Karakter Morfologi dan RAPD
Percobaan menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak dengan satu faktor yaitu konsentrasi BAP: 0; 2,22; 4,44; 8,88 dan 17,76 µM. Setiap perlakuan terdiri dari 2 botol dan diulang 6 kali. Bahan tanam yang digunakan adalah tunas in vitro yang berasal dari media BAP SK 2 umur 12 minggu, kemudian disubkultur pada media BAP yang sama. Jumlah tanaman per botol pada setiap perlakuan adalah 5. Plantlet ditanam dalam media BAP SK 3 selama
16 minggu kemudian dipindah ke media akar MS + 0,54 µM NAA selama
14 minggu selanjutnya plantlet diaklimatisasi.
Bibit berumur 2,5 bulan ditanam di lapangan dengan 6 ulangan. Jumlah tanaman contoh yang diamati tiap perlakuan adalah 12 tanaman. Rancangan percobaan yang digunakan dan cara penanaman sama seperti pada percobaan 4.2.3. Pengamatan peubah pada plantlet in vitro dan tanaman di lapangan sama seperti pada percobaan 4.2.3. Karakter morfologi yang diamati di lapangan hanya sampai fase vegetatif.
4.3. Hasil
4.3.1. Regenerasi dan Multiplikasi pada SK 1.
Eksplan memberikan respon terhadap perlakuan ZPT dalam media dengan membentuk sel yang meristematik atau embriogenik yang disebut diferensiasi. Pada saat sel mengalami diferensiasi terjadi pembelahan sel yang sangat cepat karena adanya ZPT terutama sitokinin. Sel dapat dipertahankan pada fase diferensiasi melalui subkultur berulang pada media yang sama (Schwarz et al. 2005). Apabila eksplan mempunyai titik tumbuh dengan sel-sel
meristematis ditanam dalam media regenerasi yang tepat, maka sel tersebut dapat langsung beregenerasi membentuk tunas (Zhang dan Lemaux, 2005). Sitokinin bersama-sama auksin sangat berperan dalam pembentukan tunas (Mattjik, 2005).
Eksplan sangat responsif dan langsung beregenerasi membentuk tunas dalam media mengandung 2,22-17,76 µM BAP. Penambahan 2,22 µM BAP menghasilkan tunas berukuran besar sementara penambahan 17,76 µM BAP menghasilkan tunas berukuran kecil dan kompak (Gambar 19). Eksplan dalam media BAP 2,22-17,76 µM menghasilkan 7-13 tunas/eksplan pada umur 8 MST dan tunas tersebut meningkat menjadi 13-26 tunas/eksplan pada umur 11 MST.
Gambar 19 Tunas yang tumbuh dalam media media BAP SK 1
Eksplan menunjukkan respon yang tinggi karena berasal dari mata tunas aksilar mahkota buah in vitro umur 4 minggu yang mempunyai titik tumbuh dengan sel-sel meristematis. Perlakuan BAP 8,88 µM menghasilkan tunas terbanyak yaitu 26,3 tunas, bila konsentrasi BAP ditingkatkan menjadi 17,76 µM jumlah tunas akan menurun. Jumlah tunas akibat perlakuan BAP 8,88 µM tidak berbeda nyata dengan BAP konsentrasi 4,44 µM, dan bila dibandingkan dengan kontrol maka penambahan BAP 8,88 µM dapat meningkatkan jumlah tunas 5,7 kali (Tabel 10). Sementara Imelda dan Erlyandari (2000) melaporkan dengan menggunakan nenas kultivar Queen klon Bogor pada umur 2 bulan dihasilkan 9 tunas dengan
4,44 µM BAP dan bila konsentrasi BAP ditingkatkan menjadi 8,88 µM BAP
jumlah tunas turun menjadi 2. Imelda dan Erlyandari (2000) menginduksi eksplan
langsung ke media yang mengandung BAP, sedangkan pada percobaan ini eksplan berasal dari tunas yang tumbuh pada media inisiasi. Prahardini et al.