Penelitian berlangsung selama 8 bulan dari April-Desember 2014 mulai dari survey pendahuluan sampai selesainya identifikasi spesimen herbarium, analisis kandungan senyawa kimia dan analisis bioaktivitas. Penelitian dan pengambilan sampel dilakukan di HPPB Unand Padang. Studi koleksi herbarium dan foto tumbuhan dilakukan di Herbarium Unand sedangkan analisis senyawa kimia dan uji bioaktivitas dilakukan Laboratorium Biota Sumatera Unand, Laboratorium Kimia Hasil Hutan FAHUTAN IPB dan Laboratorium Kimia Analitik FMIPA IPB.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Global Positioning System (GPS), meteran, kompas, tali, perlengkapan koleksi herbarium, alat pengukur faktor lingkungan (soil tester, sling psikometer), kamera, peralatan ekstraksi, timbangan dan perangkat gelas (erlenmayer, tabung reaksi, cawan petri, volumetrik, dll). Bahan yang digunakan adalah sampel R. deceptor dan T. papillosum, telur udang A. salina, air laut, pelarut (air, etanol dan kloroform) serta zat kimia yang diperlukan dalam uji fitokimia, uji BSLT dan uji aktivitas antioksidan.
14
Bioekologi R. deceptor
Analisis Populasi dan Karakteristik Habitat
Data yang dikumpulkan meliputi data biotik dan abiotik pada lokasi penelitian. Data faktor biotik meliputi komposisi vegetasi, pencatatan individu R. deceptor untuk data struktur populasi dan spesies agen dispersalnya. Data abiotik yang dicatat meliputi karakteristik habitat berupa faktor edafik, topografi dan iklim mikro.
Pengumpulan data populasi dan kondisi habitat dilakukan dengan membuat 5 plot tunggal berbentuk lingkaran dengan luas 0,1 ha yang ditempatkan secara purposive, dimana plot dibuat dan ditempatkan sesuai dengan keberadaan R. deceptor di lapangan.Data yang dikumpulkan adalah titik koordinat plot, ketinggian, keberadaan inang (jumlah inang, pohon penyokong) dan keberadaan R. deceptor
(jumlah, ukuran dan kondisi) mulai dari knop sampai individu yang mekar serta posisi tumbuh pada inangnya. Ilustrasi pengukuran diameter knop R. deceptor dan diameter inangnya seperti pada Gambar 4. Skema plot pengamatan seperti pada Gambar 5.
Gambar 4 Ilustrasi pengukuran diameter knop R. deceptor dan diameter inangnya. Keterangan: a). Pengukuran diameter knop R. deceptor. b). Pengukuran diameter inang.
Pada plot pengamatan tersebut juga diambil data vegetasi yaitu struktur dan komposisi tumbuhan yang berada di sekitar lokasi populasi R. deceptor. Pengambilan data dilakukan terhadap seluruh spesies yang ditemui dalam plot dihitung dan diukur diameternya pada setinggi dada (DBH / diameter at breast height) serta dibagi menurut kelompok semai dan tumbuhan bawah, sapling dan pohon. Keberadaan satwa liar baik yang diduga sebagai satwa penyebar biji, polinator maupun pengurai juga diamati. Data yang diambil adalah jenis satwa dan aktifitas yang dilakukan pada lokasi plot pengamatan.
15
C B
Gambar 5 Skema plot pengamatan R. deceptor. A = 0,001 ha (r= 1,785 m) untuk anakan dan vegetasi dasar; B = 0,01 ha (r= 5,65 m) untuk pancang; C = 0,1 ha (r= 17,85 m) untuk pohon.
Karakteristik habitat yang diukur di lapangan meliputi faktor topografis, klimatik dan faktor edafik. Faktor topografis yang diukur adalah ketinggian menggunakan GPS dan altimeter dan kemiringan tempat diukur dengan klinometer. Jarak R. deceptor dengan sumber air terdekat diukur menggunakan meteran.
Data klimatik (iklim mikro) yang dicatat meliputi kelembaban dan suhu udara menggunakan sling psikometer . Data curah hujan diperoleh dari data sekunder di lokasi yang bersumber dari instansi terkait. Data tanah yang diukur di lokasi penelitian adalah pH, kelembaban dan suhu tanah yang diukur pada permukaan tanah menggunakan soil tester. Data yang diambil dalam penelitian karakteritik habitat R. deceptor tersaji pada Tabel 1.
Bioprospeksi R. deceptor dan Inangnya Pengambilan Sampel
Sampel R. deceptor dan inangnya diambil pada setiap plot pengamatan sebanyak dua sampel. Pengambilan sampel untuk analisis fitokimia dan bioktifitas berdasarkan SNI No. 19-0428-1998 untuk pengambilan contoh padatan (BSN 1998). Bagian yang diambil adalah knop (kuncup/bonggol), akar inang tempat R. deceptor tumbuh dan batang inang. Selanjutnya sampel dibawa ke laboratorium untuk dianalisis kandungan kimianya. Sampel yang sudah berbentuk ekstrak digunakan untuk uji fitokimia, uji BSLT dan antioksidan.
16
Tabel 1 Jenis data yang diukur dalam penelitian karakteristik habitat R. deceptor Komponen Habitat Jenis Data Satuan dan atau
Keterangan A.Komponen Biotik
1. Komposisi
vegetasi a. Jumlah jenis tumbuhan total Jumlah spesies b. Jumlah jenis tumbuhan pada
setiap tingkat pertumbuhan
Jumlah jenis dari tingkat anakan, pancang, pohon c. Kerapatan tumbuhan pada
tiap tingkat pertumbuhan Individu/ha 2. Populasi
R. deceptor a. Kerapatan populasi Individu/ha b. Jumlah individu total Jumlah spesies total c. Jumlah individu berdasarkan
tingkat kehidupan Knop, mekar, hidup, mati
d. Diameter knop milimeter (mm)
3. Tumbuhan inang
a. Jumlah individu tumbuhan
inang Individu total
b. Jumlah jenis tumbuhan inang
Jumlah spesies total c. Jumlah jenis tumbuhan
penyokong tumbuhan inang Jumlah spesies total 4. Interaksi
R. deceptor dengan hewan
a. Jumlah jenis hewan yang
mengunjungi R. deceptor Total spesies yang teramati serta aktivitasnya diihitung dari perjumpaan langsung atau tanda keberadaan (jejak,
feses, dll). b. Kegiatan hewan
c. Kegiatan manusia
B. Komponen Abiotik
1. Faktor klimatik 1. Suhu udara celcius ( o
C) dengan alat Termometer 2. Kelembaban Persen (%) dengan alat
Higrometer atau Sling psikometer
3. Curah hujan mm/bulan dari
data stasiun pengamatan terdekat
2. Faktor edafik 1. ph tanah pH meter
2. Kelembaban tanah Persen (%) dengan alat Soil moisture meter
3. Suhu tanah Termometer tanah
3. Faktor
Topografis 1. Ketinggian tempat
meter dari permukaan laut (mdpl) dengan alat Altimeter atauGPS
2. Kelerengan tempat
Derajat kemiringan dengan alat Clinometer
3. Jarak dari sumber air meter (m) dihitung dari titik tumbuh R. deceptor ke sumber air terdekat
17
Ekstraksi
Sampel yang berbentuk serbuk masing-masing diambil ±20 gr untuk air diukur kadar airnya, lalu diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan etanol (3 x1000 ml) selama 24 jam pada suhu kamar. Filtrat yang diperoleh dipekatkan sampai 100 ml dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu sekitar 40-50oC dan 50 rpm. Sebanyak 5 ml ekstrak yang telah dipekatkan tersebut dikeringkan dalam oven pada suhu ±103oC untuk menetapkan rendemen ekstrak, sedangkan sisanya disimpan untuk uji bioktifitas (Sari et al, 2011).
Uji Fitokimia
Analisis fitokimia adalah salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder dari suatu jenis tumbuhan. Analisis ini berguna dalam melihat dan menentukan peluang dan potensi pemanfaatan R. deceptor dan T. papillosum yang akan terlihat dari kandungan metabolit sekunder yang dimiliki keduanya. Mann (2001) menjelaskan bahwa keberadaan dan kuantitas metabolit sekunder pada tumbuhan dipengaruhi oleh tingkat nutrisi dan pertumbuhan juga kondisi lingkungannya.
Dalam penelitian ini uji fitokimia dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif kepada ekstrak dari R. deceptor dan T. papillosum. Bagian yang diuji adalah knop R. deceptor dan bagian akar dan batang dari T. papillosum. Senyawa yang diuji keberadaannya adalah alkaloid, flavonoid, fenolik, saponin, terpenoid dan steroid.
Alkaloid. Sebanyak 0,1 g ekstrak dilarutkan dalam 10 mL CHCl3 dan 4 tetes NH4OH kemudian disaring dan filtratnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak CHCl3 dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2 M dan lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna yang berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga. Warna yang timbul menujukkan adanya alkaloid.
Saponin. Sebanyak 0,1 g ekstrak dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian dikocok selama 10 detik dan dibiarkan selama 10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil.
Triterpenoid dan steroid. Sebanyak 0,1 g ekstrak dilarutkan dengan 25 mL etanol panas (50 oC) kemudian hasilnya disaring ke dalam pinggan porselin dan diuapkan sampai kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak eter dipindahkan ke dalam lempeng tetes kemudian ditambahkan 3 tetes anhidridaasetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (Uji Lieberman-Buchard). Warna merah atau ungu menunjukkan kandungan triterpenoid sedangkan warna hijau atau biru menunjukkan kandungan steroid.
Flavonoid. Sebanyak 0,1 g ekstrak dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian ditambahkan 10 mL air panas dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 0,5 g serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mLl amil alkohol kemudian dikocok dengan kuat. Uji positif flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.
18
Kandungan Fenolik Total
Analisis kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteu yang absorbansinya diukur pada panjang gelombang 765 nm (Pourmorad et al. 2006). Standar asam galat dibuat dengan variasi konsetrasi 5-125 µg/mL dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 765 nm. Prosedur pengukuran sampel dilakukan dengan cara menimbang sampel sebanyak 100-150 mg lalu ditambahkan dengan 0,5 mL etanol, 2,5 mL aquadest dan 2,5 mL reagent Folin-Ciocalteau 50%. Campuran didiamkan selama 5 menit kemudian ditambahkan dengan 2 mL Na2CO3 7,5% dan divorteks lalu diinkubasi selama 15 menit pada suhu 45 oC. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 765 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS.
Perhitungan kandungan fenolik total menggunakan rumus berikut : TPC =
Keterangan :
C = konsentrasi Fenolik (nilai x)
V = volume ekstrak yang digunakan (ml) fp = Faktor pengenceran
g = Berat sampel yang digunakan (g)
Nilai kandungan fenolik total dinyatakan dengan ekuivalen asam galat atau gallic acid equivalent (GAE). GAE merupakan acuan umum untuk mengukur sejumlah senyawa fenolik yang terdapat dalam suatu bahan (Mongkolsilp et al. 2004).
Uji Toksisitas Larva Udang (BSLT/Brine Shrimp Lethality Test)(Meyer et al.
1982)
Ekstrak R. deceptor diuji toksisitasnya dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach. Dalam uji ini dilihat tingkat mortalitas larva udang yang disebabkan adanya peningkatan konsentrasi sampel. Sebanyak 20 ekor larva udang dimasukkan ke botol uji diikuti larutan ekstrak dan air laut. Pengujian dilakukan dengan 4 variasi konsentrasi ekstrak dengan 3 ulangan yaitu 30 µg/mL, 100 µg/mL, 500 µg/mL dan 1000 µg/mL ditambah kontrol. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan cara menghitung jumlah larva udang yang mati.
Uji Aktivitas antioksidan secara in vitro dengan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Leu et al. 2006)
Ekstrak dilarutkan dengan pelarut etanol (1 µg/mL) dan larutan yang diperoleh dijadikan larutan induk dengan konsentrasi 1.000 μg/mL. Nisbah larutan ekstrak dan larutan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) adalah 1:1. Kontrol negatif dibuat dengan mencampurkan 100 μL larutan ekstrak dan 100 μL larutan DPPH. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 °C dalam tempat yang gelap selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan
19
spektrofotometri pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dari setiap sampel dinyatakan dengan persen inhibisi.
Analisis Data
Analisis Vegetasi Pada Habitat R. deceptor (Indriyanto 2006) 1. Kerapatan (K)
Kerapatan adalah jumlah individu suatu spesies dalam suatu luasan tertentu. Parameter ini dihitung dengan persamaan:
Ki = ni / A
Ki adalah kerapatan untuk spesies i, ni adalah jumlah total individu spesies i yang terhitung dalam plot, dan A merupakan luas total plot sampel. Kerapatan relatif (KR) adalah jumlah individu spesies i (ni) proporsional terhadap jumlah total individu seluruh spesies yang dijumpai dalam plot (Σn). KR dihitung dengan persamaan:
KR = (ni / Σn) x 100% 2. Frekuensi (F)
Frekuensi adalah kesempatan menjumpai spesies dalam suatu plot, yang diperoleh dari persamaan :
Fi = jumlah plot yang diduduki spesies jumlah total plot yang dibangun
Frekuensi relatif (FR) adalah frekuensi dari individu spesies i (Fi) sebagai proporsi dari jumlah frekuensi seluruh spesies yang dijumpai dalam plot. FR dihitung dengan persamaan :
FRi = (Fi / ΣFi) x 100% 3. Dominasi (D)
Dominasi adalah proporsi dari permukaan tanah yang diduduki oleh proyeksi vertikal bagian tajuk tumbuhan ke permukaan tanah. Dominasi dihitung dengan persamaan:
Di = ai / A
ai merupakan total area yang ditutupi oleh spesies i (perkiraan melalui basal area, penutupan tajuk) dan A merupakan total area habitat yang disampling. Dominansi Relatif untuk spesies i (DRi) adalah adalah penutupan atau kelindungan untuk spesies tersebut (Di) yang diekspresikan sebagai proporsi dari total dominansi seluruh spesies. DRi dihitung dengan persamaan:
20
4. Indeks Nilai Penting (INP)
Jumlah dari ketiga pengukuran relatif untuk spesies i merupakan sebuah indeks yang disebut INP.
INP = KR + FR + DR 5. Analisis deskriptif
Analisis secara deskriptif dilakukan terhadap fakta dan data yang didapatkan di lapangan yang tidak bisa dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif.
Uji Toksisitas Larva Udang (Meyer et al. 1982)
Analisis data uji toksisitas larva udang dilakukan dengan rumus sebagai berikut :
MA (%) = (N2 : N1) x 100 % Keterangan :
MA : Mortalitas teramati (%) N1 : Jumlah larva udang awal N2 : Jumlah larva udang yang mati
Nilai mortalitas teramati yang didapat dikoreksi dengan kontrol dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
MT =
x 100 %
Keterangan :
MT : Mortalitas teramati yang terkoreksi Ma : Mortalitas teramati
Mk : Mortalitas kontrol
Data mortalitas yang diperoleh selanjutnya dianalisis menggunakan Probit Analysis Method dari software Minitab 14 untuk mengetahui Lethal Concentration (LC50).
Uji Aktivitas Antioksidan (Sari et al. 2011)
Aktivitas antioksidan dari setiap sampel dan antioksidan pembanding Vitamin C dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan rumus:
% inhibisi =
Dimana :
A : Serapan kontrol negatif (DPPH + etanol)
B : Serapan ekstrak uji (DPPH + etanol + ekstrak uji)
Nilai konsentrasi sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding ) dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC50 (inhibitor concentration 50%) dari
21
setiap sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding ) yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%. Nilai IC50 yang semakin rendah berarti aktivitas antioksidan ekstrak semakin tinggi.