BAB III METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman ketela pohon (Manihot utilissima Pohl.) dilakukan di Laboratorium Biologi / Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi USD. Determinasi tanaman ketela pohon dengan tangkai daun berwarna kemerahan, dan daun berwarna hijau dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi USD dengan berdasarkan acuan Herbarium Manihot utilissima Pohl. Collector : Emanuel M.L; Determinator : Emanuel M.L, Insula : P, Jawa; Loc : Karang Asem Baru; Altitude : 1,5 m di atas permukaan laut; dd : 6 – 12 – 1996.
2. Pemilihan bahan
Ketela yang dipilih adalah ketela pohon (Manihot utilissima Pohl.). Ketela pohon yang bagian dalamnya berwarna putih serta kulitnya berwarna coklat dan di panen pada waktu berumur 6-9 bulan. Waktu pengambilan ketela
pohon ini dilakukan pada bulan November 2012 dan Febuari 2013 di Pasar Telo, Karangkajen, Yogyakarta.
3. Preparasi limbah cair ketela pohon
Ketela pohon sebanyak 0,5 kg yang sudah dikupas kulitnya dan dicuci bersih ditampung di baskom, kemudian diblender dan diberi air 0,5 Liter. Lalu diaduk–aduk hingga air semua bercampur homogen dengan parutan ketela. Kemudian disaring dan pisahkan air dari ketela. Pada larutan cair akan terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan bawah pati dari ketela dan lapisan atas (limbah air) dalam membuat pati. Lapisan air yang diambil yaitu lapisan atas (limbah air). Diamkan limbah tersebut selama ±12 jam, agar sari pati benar-benar sudah mengendap dan air dapat digunakan pada tahap selanjutnya. 4. Pembuatan membran kitosan sebagai pembanding
Sejumlah 2 g kitosan dilarutkan dalam 100 mL asam asetat dengan konsentrasi 2% di atas hot plate sambil diaduk dengan magnetic stirrer. Larutan kitosan lalu dituang ke atas nampan yang telah dicuci alkohol 70% dan dikeringkan lalu diletakkan selama beberapa hari di udara terbuka untuk menjamin penguapan solven secara sempurna. Setelah beberapa hari maka akan terbentuk produk membran yang transparan dan fleksibel. Membran kitosan yang terbentuk lalu disimpan di dalam toples yang sudah diberi silica gel sebelumnya (Eldin, Soliman, Hashem, Tamer, 2008).
5. Pembuatan material selulosa bakteri (S) + gliserol (G)
Sebanyak 200 mL air limbah ketela pohon hasil penyaringan dituangkan ke dalam Erlenmeyer yang telah dilengkapi dengan magnetic
stirrer, ditambahkan 20,0 g gula pasir, 1,0 g urea, dan ditambahkan gliserol sebanyak 1,0 g selanjutnya dipanaskan dan diaduk hingga larut. Bila pH larutan campuran masih berkisar antara 5-6, campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat glasial hingga pH berkisar antara 3-4. Selanjutnya campuran didinginkan sebentar dan lalu dituangkan dalam keadaan hangat ke dalam nampan yang telah disterilkan dengan alkohol 70% dan telah ditutup sebagian dengan koran sambil didinginkan hingga tercapai suhu kamar. Campuran ditambahkan 50 mL Acetobacter xylinum, nampan ditutup rapat menggunakan koran lalu direkatkan dengan selotip dan difermentasi selama 7-14 hari pada suhu kamar.
Setelah 7-14 hari, penutup koran dibuka dan lapisan pelikel yang terbentuk diambil lalu dicuci berturut-turut dengan air PAM, dengan aquabidest, dengan air panas kemudian lapisan pelikel ini ditimbang dengan timbangan digital. Lapisan pelikel lalu direndam dengan larutan NaOH 3% selama 48 jam. Setelah 48 jam, lapisan pelikel ini dicuci kembali dengan aquades setelah dicuci dengan aquades lalu lapisan pelikel ini direndam dengan larutan HCl 3% selama kurang lebih 15 menit. Setelah 15 menit, lapisan pelikel ini lalu dicuci kembali dengan aquades dan dicek pH-nya dengan pH stik, jika pH pada pH stik sudah menunjukkan pH mendekati range pH netral, pencucian dengan aquades ini dihentikan kemudian air di lapisan pelikel ini dibuang lalu lapisan pelikel ini ditimbang. Setelah ditimbang, lapisan pelikel ini lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 400 C selama kurang lebih 2 minggu.
Setelah 2 minggu atau setelah air pada nampan ini kering, lapisan pelikel ini dikeluarkan dari oven dan dijemur dibawah cahaya matahari selama kurang lebih 1 minggu dengan sebelumnya nampan yang berisi pelikel ini ditutup dengan kain hitam. Setelah 1 minggu atau setelah lapisan pelikel ini membentuk lembaran tipis, lapisan pelikel ini ditimbang lalu disimpan di dalam plastik dan diletakkan di dalam toples yang sudah diisi silica gel sebelumnya (Chawla, Bajaj, Survase, Singhal, 2008).
6. Pembuatan material selulosa bakteri (S) + gliserol (G) + kitosan (K) Sebanyak 200 mL air limbah ketela pohon hasil penyaringan dituangkan ke dalam Erlenmeyer yang telah dilengkapi dengan magnetic stirrer, ditambahkan 20,0 g gula pasir, 1,0 g urea, dan ditambahkan gliserol sebanyak 1,0 g selanjutnya dipanaskan dan diaduk hingga larut. Bila pH larutan campuran masih berkisar antara 5-6, campuran diasamkan dengan penambahan asam asetat glasial hingga pH berkisar antara 3-4. Selanjutnya campuran didinginkan sebentar dan lalu dituangkan dalam keadaan hangat ke dalam nampan yang telah disterilkan dengan alkohol 70% dan telah ditutup sebagian dengan koran sambil didinginkan hingga tercapai suhu kamar. Campuran ditambahkan 50 mL Acetobacter xylinum, nampan ditutup rapat menggunakan koran lalu direkatkan dengan selotip dan difermentasi selama 10 hari pada suhu kamar.
Setelah 10 hari, penutup koran dibuka dan lapisan pelikel yang terbentuk diambil lalu dicuci berturut-turut dengan air PAM, dengan aquades, dengan air panas kemudian lapisan pelikel ini ditimbang dengan timbangan
digital. Lapisan pelikel lalu direndam dengan larutan NaOH 3% selama 48 jam. Setelah 48 jam, lapisan pelikel ini dicuci kembali dengan aquades setelah dicuci dengan aquades lalu lapisan pelikel ini direndam dengan larutan HCl 3% selama kurang lebih 15 menit. Setelah 15 menit, lapisan pelikel ini lalu dicuci kembali dengan aquades dan dicek pH-nya dengan pH stik hingga menunjukkan pH mendekati range pH netral.
Kemudian ditambahkan 2 g kitosan yang telah dilarutkan dalam 100 mL asam asetat 2% dalam keadaan panas kedalam wadah yang terdapat pelikel/membran selulosa bakteri. Pelikel kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 40-500C . Setelah kering, membran selulosa-gliserol-kitosan ini dimasukkan dalam toples yang berisi silica gel (Chawla, et al., 2009).
7. Analisa karakteristik biomaterial
a. Analisis sifat fisik secara makroskopis.
Analisis ini meliputi pengamatan dari warna, tekstur, bentuk dan transparansi dari masing-masing sampel.
b. Analisis gugus fungsi menggunakan instrumen FT-IR
Analisis ini menggunakan seperangkat alat FT-IR dan dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakutas MIPA UII. Langkah-langkahnya adalah lapisan tipis atau pelikel yang diperoleh dari hasil fermentasi dijepit pada tempat sampel kemudian diletakkan pada alat ke arah sinar inframerah. Hasilnya direkam ke dalam kertas berskala berupa alur kurva bilangan gelombang terhadap intensitas.
c. Analisis morfologi permukaan menggunakan instrumen SEM
Foto permukaan dilihat menggunakan instrumen SEM. Langkah-langkahnya adalah sebagai berikut material sampel dipotong sedemikian rupa, lalu sampel diberi doubel tape karbon kemudian sampel ditempatkan di atas tempat sampel yang terbuat dari tembaga. Sampel disepuh dengan dengan emas (coating) dengan alat ion coater selama kurang lebih 5 menit yang sebelumnya dilakukan proses pemvakuman. Selanjutnya sampel dimasukkan ke unit electron gun melalui bilik pergantian sampel. Kemudian sampel diset dengan bantuan microstage sampai mendapatkan fokus yang tepat. Tombol utama pada posisi ON dan diset detector Accelerate voltage set, 20 kilo volt.
d. Analisis kristalinitas dengan alat X-Ray Diffraction (XRD)
Analisis XRD dilakukan dengan memakai instrumen X-Ray Diffraction yang dilakukan di Laboratorium FMIPA UNY. Langkah-langkahnya adalah lembaran film dipotong dengan ukuran 2x2 cm2. Sampel tersebut kemudian dipasang di sample holder dan sampel diusahakan rata di atas sample holder. Selanjutnya, pendingin alat XRD dihidupkan dan instrumen XRD dihidupkan lalu diatur kondisi alat
dengan sudut putar 2θ = 2° sampai 80°, scan step = 0,04 dan scan speed =
4°/menit serta tegangan dan arus pada instrumen disesuaikan dengan standard measurement dari instrumen dan dirotasikan agar benar-benar terorientasi secara acak. Hasil uji ini berupa difraktrogram hubungan
8. Sterilisasi produk
Produk biomaterial yang sudah dikeringkan serta membran kitosan yang telah dibuat lalu dipotong menjadi beberapa bagian dengan ukuran 1x1 cm2 lalu dimasukkan ke dalam cawan petri dan selanjutnya dimasukkan ke dalam autoklaf dan disterilisasi pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah disterilisasi, produk biomaterial ini siap digunakan.
9. Pengujian aktivitas antimikroba
a. Pembuatan suspensi bakteri uji
Isolat murni Staphylococcus aureus ditambahkan ke dalam media BHI broth yang diinkubasi pada 37oC selama kurang lebih 4 jam sampai kekeruhan Brain Heart Infusion broth (BHI broth) menyamai kekeruhannya 0,5 McFarland (Christoforus, 2010).
b. Pembuatan media
Media yang digunakan untuk uji aktivitas antimikroba adalah MHA. Larutan MHA dituangkan ke dalam 5 cawan petri masing-masing sebanyak 25 mL dan dibiarkan beberapa saat hingga memadat (Christoforus, 2010).
c. Penanaman bakteri uji
Hasil suspensi bakteri uji dispread ke dalam media Mueller-Hinton Agar (MHA) dengan cara dioleskan secara merata dengan menggunakan lidi-kapas steril, lalu didiamkan kurang lebih selama 5 menit (Christoforus, 2010).
d. Pemberian kontrol positif pada bakteri uji
Sebagai kontrol positif, digunakan antibiotik Amoxicillin. Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar kemudian diberi paper disc
Amoxicillin. Kemudian inkubasikan pada 37oC selama 24 jam (Ardhuha, F., Harapan, 2010).
e. Pemberian kontrol negatif pada bakteri uji
Sebagai kontrol negatif, digunakan asam asetat. Sebanyak 20 µl asam asetat diteteskan pada paper disk. Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar kemudian diberi paper disk berisi asam asetat. Kemudian diinkubasikan pada 37oC selama 24 jam.
f. Pemberian biomaterial selulosa, selulosa bakteri-gliserol (SG), kitosan (K), dan selulosa bakteri-gliserol-kitosan (SGK) pada bakteri uji
Bakteri uji yang sudah ditanamkan pada Mueller-Hinton Agar kemudian diberi potongan biomaterial yang sudah disterilisasi sebelumnya. Biomaterial ini dipotong serupa dengan bentuk dan ukuran paper disc yang bertindak sebagai kontrol positif dan kontrol negatif. Diletakkan potongan biomaterial per cawan petri (Selulosa Gliserol (SG), Kitosan (K), Selulosa bakteri-Gliserol-Kitosan (SGK). Kemudian inkubasikan pada 37oC selama 24 jam.
g. Pengukuran zona hambat
Pengukuran zona hambat dilakukan dengan mengukur diameter zona hambat dalam millimeter, kemudian dihitung persentase kekuatan aktivitas daya hambat dihitung menggunakan rumus berikut :
% daya hambat =
(Ardhuha dan Harapan, 2010). (diameter zona hambat zat uji – kontrol negatif)
x 100% (zona hambat kontrol positif)