BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Pengumpulan Tanaman
Tanaman rosemary (Rosmarinus officinalis L.) didistribusikan oleh Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota 50189, Jawa Tengah, Indonesia) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur dipanen pada bulan Juni 2014. Bagian yang digunakan hanya bagian daunnya. Daun yang dipilih adalah daun yang segar, berwarna hijau, dan bentuk yang masih utuh.
2. Determinasi Tanaman
Tanaman rosemary ini didapatkan melalui distributor komersil maka diperlukan pemastian akan kebenaran tanaman yang digunakan. Sampel daun rosemary dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada.
3. Penyiapan Simplisia
Daun rosemary dipetik kemudian dicuci bersih dibawah air mengalir. Daun dipotong-potong, dikeringkan di atas tampah ditutupi kain hitam diberi sirkulasi udara yang cukup dengan sinar matahari. Pengeringan pertama dilakukan dalam waktu tujuh hari, setelah tujuh hari daun rosemary dipilah, daun yang sudah kering (berwarna hijau kecoklatan dan mudah rapuh saat diremas) dari yang masih kurang kering. Daun yang kurang kering dilanjutkan dengan pengeringan dingin di dalam kulkas selama tujuh hari. Daun rosemary yang sudah kering,
!
27
dihaluskan menggunakan blender, serbuk disimpan dalam plastik clip yang diberi silika penjerap lembab dalam wadah tertutup di suhu ruang (Alfredo, 2012).
4. Ekstraksi Simplisia Daun Rosemary
7,3 g serbuk simplisia daun rosemary
1. Ditambahkan metanol absolut 30 mL. 2. Direfluks selama 30 menit.
3. Proses refluks diulang tiga kali dengan penggantian pelarut. 4. Campuran disaring lalu digabungkan.
Gabungan ekstrak
1. Dipekatkan menggunakan rotary evaporator selama 5 menit. 2. Dikeringkan di atas waterbath pada suhu 800C hingga mencapai
bobot tetap. Residu serbuk hijau tua
Diambil 0,5 g
1. Ditambahkan 10 mL metanol 60%. 2. Divortex selama 1 menit.
3. Disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. 4. Disaring, endapan yang tertahan dikumpulkan.
Endapan
1. Ditambahkan 10 mL metanol absolut.
2. Disaring kemudian cairan dikumpulkan dan dipekatkan dengan rotary evaporator.
3. Dilanjutkan dengan pengeringan dengan waterbath pada suhu 800C sampai mencapai bobot tetap.
Serbuk ekstrak metanol daun rosemary !
Gambar 7. Skema ekstraksi simplisia daun rosemary (Abe, dkk., 2002).
!
5. Panen Sel
Pada awalnya sel ditanam dan diinkubasi dalam cawan petri hingga konfluen, kemudian media kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan mikropipet. Ke dalam cawan petri ditambahkan PBS untuk mencuci kemudian dibuang dan ditambahkan 0,5 mL tripsin secara merata dalam cawan petri, setelah itu ditutup dan didiamkan selama 3 menit hingga sel terlepas di dalam inkubator. Setelah 4 menit ditambahkan media RPMI lengkap, dicuplik sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung jumlah sel yang diperlukan selama pengujian dengan:
jumlah!sel!kuadran!1+2+3+4
4 ×
10! mL
Sejumlah sel terhitung yang diperlukan ditambahkan media RPMI hingga 10 mL dan dimasukkan sebanyak 100 !L ke dalam 96 well-plate untuk uji MTT, 2 mL ke dalam 6 well-plate untuk uji Annexin V Fluos, dan 1 mL ke dalam 24 well-plate dengan cover slip untuk uji imunositokimia, diinkubasi selama 24 jam hingga konfluen (CCRC, 2009).
6. Preparasi Larutan Uji
Sepuluh miligram sampel dilarutkan dalam 100 !L DMSO kemudian dilakukan pengenceran ke seri konsentrasi yang diinginkan. Pada tahap pengenceran sampel, digunakan media kultur sebagai pelarutnya (CCRC, 2009).
7. Pengujian Viabilitas Sel dengan Metode MTT
Sel yang telah diinkubasi selama 24 jam di dalam well-plate dan didapati telah konfluen dapat segera diberi perlakuan. Pertama media kultur dibuang
!
29
diberi 100 !L sampel yang telah diencerkan, pada kolom kontrol sel cukup diberi media kultur sedangkan pada kolom kontrol media dapat dikosongkan saja, lalu diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2. Setelah inkubasi 24 jam, disiapkan larutan MTT yang telah dicampur dengan media kultur terlebih dahulu kemudian media kultur dalam well-plate dapat dibuang lalu diberi 100 !L PBS dan dibuang, ke dalam tiap lubang diberi 110 !L larutan MTT dan diinkubasi selama 4 jam. Setelah 4 jam ke dalam tiap lubang diberi 100 !L reagen stopper SDS kemudian diinkubasi di ruang selama 24 jam. Setelah inkubasi, dilakukan pembacaan absorbansi menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 595 nm (CCRC, 2009).
8. Pengujian Apoptosis Sel dengan Metode Annexin V Fluos
Uji apoptosis sel menggunakan metode annexin dilakukan dengan menanam sel (dengan populasi 500.000-1.000.000 sel/mL) sejumlah 2 mL kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah konfluen, media kultur dibuang kemudian diberi 100 !L PBS lalu dibuang. Tiap lubang diberi sampel sebanyak 2 mL dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, sel dalam tiap lubang diambil dengan mikropipet dipindahkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 1 mL PBS, kemudian diambil lagi dan dimasukkan ke conical tube. Pada well-plate diberi 200 !L tripsin diinkubasi selama 3 menit, lalu dilihat dengan mikroskop apabila sel sudah terlepas diberi 1 mL media kultur dan ditampung lagi ke dalam conical tube. Conical tube disentrifugasi selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam eppendorf sebanyak 1 mL. Campuran dalam
eppendorf disentrifugasi (5 menit, 5000 rpm). Tahap selanjutnya adalah preparasi reagen annexin pada eppendorf yang dibalut alumunium foil diisi dengan 550 !L buffer dan diberi 10 !L!annexin juga 10 !L propidium iodida. Eppendorf yang berisi sampel dibuang supernatannya kemudian diberi reagen 100 !L lalu diinkubasi 10 menit. Setelah inkubasi 10 menit diberi 300 !L buffer, dan sampel dianalisis mengunakan flowcytometry (CCRC, 2009).
9. Pengujian Ekspresi ER! dengan Metode Imunositokimia
Pengujan imunositokimia dilakukan dengan menanam sel dalam 24 well-plate diberi cover slip (jumlah sel 500.000 sel/mL) sejumlah 1 mL. Setelah inkubasi 24 jam dan sel sudah konfluen, media kultur dibuang lalu diberi 500 !L PBS dan dibuang. Sel diberi perlakuan dengan memberikan 1 mL sampel dan diinkubasi 24 jam, setelah inkubasi cover slip diangkat dan dipindahkan ke kaca preparat. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian difiksasi menggunakan metanol 300 !L lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi aquadest lalu dibuang (dilakukan dua kali), diberi hidrogen peroksida 100 !L!selama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi larutan blocking 100 !L selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer (ERα) 100 !L selama 1 jam setelah itu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi antibodi sekunder 100 !L selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Cover slip diberi HRP sebanyak 100 !L selama 10 menit kemudian dibuang dan diberi PBS, lalu diberi larutan DAB 100 !L diinkubasi 3 menit dan diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip diberi 100 !L Hematoxylin selama 5 menit dan diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip digenangi etanol absolut dan segera dibuang juga xylol dan
!
31
segera dibuang, preparat dikeringkan terlebih dahulu lalu diawetkan. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop (CCRC, 2009).
F. Tata Cara Analisis Hasil
