BAB III METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman daun ketela pohon (Manihot utillisima Pohl.) dilakukan dengan cara mencocokkan dengan kunci determinasi pada buku Flora untuk Sekolah di Indonesia.
2. Preparasi bahan
a. Pengumpulan, pengeringan daun ketela pohon dan pembuatan serbuk.
Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun yang telah dikeringkan. Proses penanaman, pengeringan dan pembuatan serbuk daun dilakukan oleh petugas di Merapi Farma Kaliurang.
b. Pembuatan ekstrak etanol daun ketela pohon
Ekstrak etanol daun ketela pohon dibuat dengan menimbang 40 gram serbuk daun ketela pohon lalu dimasukkan ke dalam kantong dari kertas saring. Serbuk daun ketela pohon dalam kantong dimasukkan dalam labu sokhlet kemudian diberi pelarut etanol sebanyak 2 kali sirkulasi. Proses sokhletasi dilakukan hingga cairan yang terekstraksi mendekati jernih dengan suhu ± 50-600 C. Timbang cawan porselen kering kemudian ekstrak kental dimasukkan ke dalam cawan yang sudah ditara dilanjutkan penguapan mendekati kering dengan oven pada suhu 500C (Anonim, 1986). Timbang ekstrak kering yang didapat untuk mengetahui % rendemen.
( )
(
gram)
100% diekstrak yang serbuk berat (gram kering ekstrak berat Rendemen % = × (9)PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
c. Pembuatan larutan ekstrak etanol daun ketela pohon.
Larutan ekstrak 6,4% b/v dibuat dengan menimbang lebih kurang 6,4 gram ekstrak kering daun ketela pohon kemudian dilarutkan dengan aquadest 1000 C sampai 100 ml pada labu ukur 100,0 ml.
d. Pembuatan larutan timbal asetat.
Larutan timbal asetat 0,004% b/v dibuat dengan menimbang lebih kurang 0,004 gram serbuk timbal asetat kemudian ditambah aquadest 1000 C sampai 100 ml pada labu ukur 100,0 ml. Timbal asetat (Pb(CH3COO)2.3H2O) berupa serbuk berwarna putih. Timbal asetat dilarutkan dalam aquadest 1000 C (Anonim, 1995b) hingga diperoleh konsentrasi larutan timbal asetat 0,04 mg/L. Menurut Anonim (2008c), reaksi antara timbal asetat dengan air menghasilkan timbal asetat trihidrat (10).
Pb(CH3COO)2 + 3 H2O Pb(CH3COO)2 . 3H2O
(10) Aquadest 1000 C digunakan untuk melarutkan timbal karena timbal sulit larut dalam air dingin dan air asam, tapi larut dalam asam nitrit, asam asetat dan asam sulfat pekat. Aquadest merupakan pelarut universal yang sifatnya netral dan tidak beracun.
e. Pembuatan larutan Na2CaEDTA.
Larutan Na2CaEDTA 151,2 % b/v dibuat dengan menimbang 151,2 gram serbuk Na2CaEDTA kemudian ditambah larutan saline (NaCl 0,9% 0,1 N) sampai 100 ml pada labu ukur 100,0 ml.
39
3. Uji analisis kualitatif rutin pada daun ketela pohon
Ekstrak kering hasil sokhletasi, ditimbang sebanyak 640 mg lalu ditambahkan etanol 95% hingga volumenya tepat 10 ml.
Fase diam : selulosa
Fase gerak : n-butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5) v/v, fase atas Deteksi : UV 254 nm; 365 nm; uap amonia; AlCl3
Pembanding : rutin 0,1 % b/v
4. Penyiapan hewan uji
Penyiapan hewan uji dilakukan dengan cara sepuluh pasang tikus jantan dan betina dikawinkan sehingga bunting. Setelah dua puluh hari masa organogenesis dan dilahirkan, anak tikus yang berumur tiga minggu dipisahkan dari induknya. Tikus betina yang berumur 6-8 minggu dipilih sebagai hewan uji.
Persiapan hewan uji dilakukan beberapa bulan sebelum penelitian agar bisa mengendalikan variabel pengacau, seperti asupan makanan dan minuman selalu dikendalikan dan yang lebih penting lagi umur dari hewan uji benar – benar dapat dipastikan. Dalam penelitian ini asupan makanan yang diberikan adalah pelet tipe BR2 dengan pemberian 10 g/hari/ekor sedangkan untuk minuman diberi aquadest yang selalu baru setiap harinya.
Hewan uji yang digunakan adalah yang berjenis kelamin betina. Kemudian dipelihara hingga tikus yang dipilih telah siap untuk dijadikan hewan uji dalam penelitian ini baik dari segi umur dan juga berat badannya. Penge ndalian hewan uji
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ini diharapkan mapu mengurangi variabel pengacau yng berasal dari hewan uji dan lingkungan.
5. Optimasi lama pemejanan timbal yang mencapai kadar toksik yang membutuhkan terapi khelasi
Optimasi lama pemejanan ini dilakukan pada 8 ekor tik us. Dosis timbal yang dipejankan adalah 0,5 g/kgBB/oral/hari/tikus (Hariono, 2005). Center for Disease Control (CDC) menyarankan penggunaan terapi khelasi jika kadar timbal dalam darah > 0,70 ppm. Menurut Hariono (2005), kadar timbal darah ya ng membutuhkan terapi khelasi dicapai pada hari ke-30 (0,75 ppm). Menurut Wahyunengsih, Fedilia, Astoro, Putri (2007), kadar toksik yang membutuhkan khelasi dicapai pada hari ke-40. Hasil pengukuran dapat dilihat pada lampiran 8.
6. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Hewan uji dibagi menjadi 4 kelompok tiap kelompok terdiri dari 7 ekor hewan uji.
Kelompok I : kontrol negatif (aquadest) Kelompok II : kontrol positif (timbal) Kelompok III : timbal-Na2CaEDTA
Kelompok IV : perlakuan timbal-Na2CaEDTA dilanjutkan dengan ekstrak etanol daun ketela pohon
Kelompok I merupakan kelompok kontrol negatif. Kontrol negatif adalah larutan pensuspensi yang digunakan untuk melarutkan ekstrak etanol daun ketela pohon yang akan dipejankan pada hewan uji. Dalam penelitian ini menggunakan
41
aquadest. Pemilihan aquadest dikarenakan senyawa (baik timbal maupun rutin) mempunyai kelarutan yang baik dalam aquadest. Selain itu, aquadest merupakan pelarut yang aman bagi hewan uji.
Kelompok II merupakan kelompok kontrol timbal. Hewan uji pada kelompok perlakuan ini dipejankan timbal asetat dengan dosis 0,5 g/kgBB/hari secara per oral (Hariono, 2005) selama 30 hari dengan volume pemberian disesuaikan dengan berat badan tiap hewan uji.
Kelompok III dapat berfungsi sebagai kontrol terhadap kelompok timbal-Na2CaEDTA dilanjutkan pemberian ekstrak etanol daun ketela pohon tetapi juga dapat berfungsi sebagai perlakuan terhadap kontrol negatif dan kontrol positif. Pada hari ke-31 hingga hari ke-40 diberi antiracun Na2CaEDTA. Pemberian Na2CaEDTA dengan dosis 189 mg/kg BB secara intra muskular (Katzung, 2004) dimaksudkan untuk melihat apakah Na2CaEDTA dapat menurunkan kadar timbal dalam darah sesuai dengan literatur.
Kelompok perlakuan IV yaitu kelompok perlakuan timbal-Na2CaEDTA dilanjutkan ekstrak etanol daun ketela pohon. Pada kelompok ini, setelah dua jam pemberian Na2CaEDTA hewan uji dipejankan ekstrak etanol daun ketela pohon dengan dosis 800 mg/kg BB secara per oral (Adimunca, 1998). Pada dosis 800 mg/kg BB secara per oral menunjukkan kemampuan menghambat kerusakan sel hati. Hati merupakan tempat terjadinya detoksifikasi racun. Timbal merupakan logam yang tidak dibutuhkan oleh tubuh yang merupakan racun. Kemampuan ekstrak etanol dosis 800 mg/kg BB secara per oral dalam menghambat kerusakan sel hati diharapkan juga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dapat membantu penawarracunan timbal. Waktu antara pemberian Na2CaEDTA dan ekstrak etanol daun ketela pohon dijeda selama 2 jam berdasarkan t ½ eliminasi Na2CaEDTA yaitu 2 jam. Dengan membandingkan kadar timbal dalam darah antar kelompok, maka dapat diamati apakah pemberian ekstrak etanol daun ketela pohon setelah Na2CaEDTA efektif dalam menurunkan kadar timbal dalam darah hewan uji.
7. Penanganan hewan uji
Larutan timbal asetat dosis 0,5 g/kgBB/hari secara per oral diberikan ke hewan uji kelompok kontrol dan perlakuan timbal selama 30 hari. Antiracun Na2CaEDTA diberikan pada hari ke-31 sampai 40 dengan dosis 189 mg/kg BB tikus secara intra muskular. Setelah dua jam pemberian Na2CaEDTA, ekstrak etanol daun ketela pohon dengan dosis 800 mg/kgBB tikus diberikan secara per oral pada hari ke-31 sampai 40.
8. Pengukuran kadar timbal darah dengan Spektroskopi Serapan Atom
a. Preparasi sampel.
Darah tikus diambil dari sinus orbitalis mata, ditampung dalam effendrof, kemudian ditimbang. Sampel didestruksi dengan HNO3 p 10-15 ml dan HClO4 0,5 ml hingga jernih dan tidak berasap kuning. Didinginkan dan volumenya ditepatkan menjadi 10 ml. Sampel aquadest, air minum, dan pakan tikus juga diukur kadar timbalnya.
Berat sampel darah yang diambil dari sinus orbitalis mata harus lebih dari 0,5 gram karena kadar timbal dalam darah sangat kecil sehingga diperlukan berat
43
sampel yang cukup banyak untuk dapat terukur. Destruksi sampel darah berdasarkan metode kimia basah (wet chemical method). Efektifitas metode ini dilihat dari kemampuan oksidasinya yang bergantung pada penambahan asam dan temperatur maksimal, sesuai titik didih asam yang digunakan.
HNO3 pekat akan melarutkan timbal menjadi timbal nitrat yang dapat larut. Kekuatan oksidasinya meningkat dengan penambahan perklorat dan peningkatan suhu serta tekanan saat proses digesti.
HClO4 pekat (60-72%) akan menguraikan senyawa organik dalam suhu tinggi (Walter, Chalk, and Kingston, 1998). Campuran HClO4 dan HNO3 digunakan untuk mengontrol proses digesti senyawa organik karena reaktivitas HClO4 yang besar (dapat meledak). Jika dicampur dengan HClO4, HNO3 akan melarutkan timbal. Jika temperaturnya dinaikkan, HClO4 akan menyempurnakan penguraian senyawa yang tidak dapat terurai oleh HNO3.
Penambahan pereaksi HNO3 p dan HClO4 pada sampel darah akan menghasilkan garam Pb2+ yang mudah larut dan lepas dari ikatannya dengan protein darah. Reaksinya adalah sebagai berikut:
3 Pb + 8 HNO3 3 Pb2++ 6 NO3 + 2 NO + 4 H2O
(11) (Vogel, 1979) Sampel dipanaskan hingga jernih, tidak berasap kuning, dan hampir mendekati kering untuk menguapkan pereaksi-pereaksi tersebut. Tujuan filtrasi sampel hasil destruksi adalah untuk menghilangkan endapan yang terbentuk selama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
proses destruksi terjadi. Selain itu, larutan sampel harus dalam keadaan jernih sebab kejernihan menjadi tanda bahwa seluruh material organik sudah terdestruksi.
b. Pengaturan spektroskopi serapan atom (SSA).
Pengaturan SSA untuk pengaturan kadar timbal adalah sebagai berikut : Sumber cahaya : lampu hollow cathode (timbal)
Arus lampu : 7,5 mA Panjang gelombang : 283,3 nm
Celah : 1,3 nm
Pengatom : standar burner
Oksidan : udara
Tekanan oksidan : 1,60 kg/cm2 (99,5l/menit) Bahan bakar : C2H2
Tekanan bahan bakar : 0,30 kg/cm2 (2,3 L/menit) Tinggi burner : 7,5 mm
c. Pembuatan kurva baku
1) Pembuatan larutan baku timbal
Larutan standar timbal 1000 ppm diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambah aquadest hingga volumenya tepat 10 ml. Dari larutan ini, dibuat seri larutan baku dengan konsentrasi 0,5 ppm, 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, dan 8 ppm.
2) Pembuatan kurva baku timbal
Kurva baku dibuat dengan mengukur nilai serapan seri kadar larutan baku timbal pada ? 283,3 nm menggunakan SSA. Nilai serapan dan kadar dibuat
45
persamaan regresi linear sehingga diperoleh persamaan Y= bX + a (Y: nilai serapan; X: kadar senyawa (mg/L); b: slope persamaan; a: intersept).
d. Penentuan kadar timbal darah kelompok perlakuan
Nilai serapan dan mean konsentrasi yang diperoleh (ppm) dihitung dengan rumus (12) sehingga diperoleh kadar timbal dalam sampel.
( )( ) ( ) faktor pengencera n gram berat volume blanko ppm -sampel larutan ppm (ppm) Pb Kadar = × (12) (Anonim, 1980)