BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Ekstrak kulit buah manggis diperoleh dari PT. INDUSTRI JAMU BOROBUDUR Semarang yang telah diuji identitasnya, dibuktikan dengan Certificate of Analysis (Lampiran 1).
2. Pembuatan emulgel antiacne ekstrak kulit buah manggis a. Formula
Formula yang digunakan untuk pembuatan emulgel antiacne ekstrak kulit buah manggis mengacu pada jurnal Optimization of Chlorphenesin Emulgel Formulation (Mohammed, 2004) dengan formula: Chlorphenesin 0,5 g HPMC 1 g Liquid paraffin 5 g Tween 20 0,6 g Span 20 0,9 g Propylene glycol 5 g Ethanol 2,5 g Metil paraben 0,03 g Propil paraben 0,01 g Purified water to 100 g
Tabel IV. Formula emulgel ekstrak kulit buah manggis yang telah dimodifikasi (100 gram):
Bahan (gram) Formula
1 2 3 4 5 6 7 Ekstrak kulit buah manggis 3 3 3 3 3 3 3 Etanol 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 Carbopol 940 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 Tween 20 1 1 1 1 1 1 1 Span 20 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Parafin cair 5 5 5 5 5 5 5 Propilen glikol 5 5 5 5 5 5 5 Metil paraben 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 Propil paraben 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 Trietanolamin 2 2 2 2 2 2 2 Aquadest 74 74 74 74 73 73 73
b. Pembuatan emulgel antiacne ekstrak kulit buah manggis
Carbopol 940 dikembangkan dengan menggunakan 60 mL aquadest dari formula selama 24 jam. Fase air dibuat dengan mencampur tween 20 dengan propilen glikol yang sebelumnya telah dicampur metil paraben dan propil paraben, dipanaskan di atas waterbath suhu 70 - 80ºC dan diaduk sampai homogen. Fase minyak dibuat dengan mencampur span 20, parafin cair, dan ekstrak kulit buah manggis yang telah dilarutkan dalam etanol, dipanaskan juga di atas waterbath suhu 70 - 80ºC dan diaduk sampai homogen. Setelah homogen, fase minyak dicampurkan ke dalam fase air menggunakan mixer dengan kecepatan 300 rpm selama 10 menit.
Emulsi yang terbentuk kemudian dicampurkan dengan carbopol 940 yang sebelumnya telah dikembangkan menggunakan mixer dengan kecepatan 300 rpm selama 10 menit. Selanjutnya, TEA ditambahkan ke
dalam campuran dan diaduk kembali menggunakan mixer dengan kecepatan 300 rpm selama 5 menit.
c. Sterilisasi emulgel antiacne ekstrak kulit buah manggis
Sediaan emulgel yang telah jadi dimasukkan ke dalam beaker glass, ditutup menggunakan aluminium foil lalu direkatkan. Emulgel kemudian disterilisasi secara panas basah menggunakan autoklaf pada suhu 115ºC selama 20 menit (Cahyono, 2014). Emulgel yang sudah disterilisasi dikeluarkan dan didinginkan sejenak. Emulgel siap diuji. 3. Uji Sterilitas
a. Pembuatan media
Media yang digunakan untuk uji sterilitas adalah Nutrient Agar (NA). Sebanyak 15 mL media NA yang telah jadi (ditandai dengan warna cairan media menjadi kuning bening), dituang ke dalam tabung reaksi kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Media NA yang telah steril dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat.
b. Uji sterilitas
Jarum ose yang akan digunakan, dipanaskan hingga membara dari pangkal hingga ke ujung ose. Diambil satu ose emulgel yang telah disterilisasi kemudian digoreskan pada permukaan NA dalam cawan petri secara zig-zag. Cawan petri dibungkus dengan plastik wrap dan diinkubasikan terbalik selama 24 jam pada suhu kamar. Hasil yang diperoleh diamati lalu dibandingkan dengan kontrol kontaminasi media.
4. Uji pH emulgel
Pengukuran pH menggunakan indikator universal, yaitu dengan memasukkan indikator pH universal (pH strips) ke dalam emulgel yang telah dibuat. Nilai pH yang diinginkan adalah berada dalam rentang pH yang tidak mengiritasi kulit yaitu antara 4,5 – 6 (Tresna, 2010).
5. Uji tipe emulgel
Emulgel ditimbang dan diletakkan di atas gelas arloji. Aquadest dan parafin cair masing – masing ditambahkan ke dalam emulgel dengan volume dua kali lipat volume emulgel dan diaduk dengan batang pengaduk hingga merata. Pengamatan dilakukan dengan melihat apakah emulgel bercampur atau tidak. Sebagai penegasan dilakukan juga uji tipe emulsi dengan langkah cara yang sama.
6. Uji sifat fisik emulgel a. Uji viskositas
Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscotester Rion seri VT 04. Sediaan emulgel dimasukkan dalam wadah dan dipasang pada portable viscotester. Ukuran rotor yang digunakan adalah rotor nomor dua. Viskositas emulgel diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Viskositas yang dikehendaki dalam penelitian ini antara 200 – 300 dPa.s. Pengujian viskositas dilakukan dalam lima periode, yaitu 48 jam setelah emulgel selesai dibuat, 7 hari, 15 hari, 21 hari dan 1 bulan untuk mengetahui persentase pergeseran viskositasnya. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali untuk tiap formula.
b. Uji daya sebar
Sediaan emulgel ditimbang seberat 1 gram dan diletakkan di tengah kaca bulat berskala. Di atas emulgel diletakkan kaca bulat lain dan beban sehingga berat total kaca bulat dengan beban adalah 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat penyebarannya (Garg et al, 2002). Daya sebar yang dikehendaki di dalam penelitian ini yaitu 3 – 5 cm. Pengujian daya sebar dilakukan pada 48 jam setelah emulgel selesai dibuat. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali untuk tiap formula.
7. Uji stabilitas fisik emulgel
Uji stabilitas fisik dilihat dari persentase pergeseran viskositas setelah penyimpanan selama satu bulan. Persentase pergeseran viskositas dihitung dengan cara selisih viskositas setelah satu bulan penyimpanan dan viskositas setelah 48 jam pendiaman dikalikan 100%.
8. Uji aktivitas antibakteri emulgel terhadap S. epidermidis a. Pembuatan stok bakteri Staphylococcus epidermidis
Sebanyak 10 mL media Muller Hinton Agar (MHA) dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit. Pada suhu 45-50ºC, tabung reaksi dimiringkan dan dibiarkan memadat. Diambil 1 ose biakan murni Staphylococcus epidermidis dan diinokulasikan secara goresan zig-zag, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam ruang inkubasi.
b. Pembuatan suspensi Staphylococcus epidermidis
Diambil dua ose koloni bakteri Staphylococcus epidermidis dari stok, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi media Muller Hinton Broth (MHB) steril, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam ruang inkubasi. Selanjutnya kekeruhan suspensi bakteri Staphylococcus epidermidis disesuaikan dengan standar 1 Mac Farland (3 x 108 CFU/mL).
c. Pembuatan kontrol kontaminasi
Media MHA steril dituang ke dalam cawan petri, dan ditunggu hingga memadat. Cawan petri kemudian dibungkus plastik wrap dan diinkubasi selama 24 jam dalam ruang inkubasi. Diamati dan dibandingkan dengan perlakuan.
d. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus epidermidis Media MHA steril dengan suhu 45-50ºC dituang ke dalam cawan petri steril, kemudian suspensi bakteri uji dengan kepadatan dan jumlah yang sama dengan suspensi bakteri uji pada perlakuan dituang ke cawan petri tersebut dan digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Cawan petri kemudian dibungkus plastik wrap dan diinkubasi selama 24 jam dalam ruang inkubasi. Setelah diinkubasi, diamati pertumbuhan bakteri uji melalui kekeruhan media dan dibandingkan dengan perlakuan.
e. Uji daya antibakteri emulgel terhadap Staphylococcus epidermidis Cawan petri diameter 12 cm yang telah berisi 15 mL MHA steril sebagai layer bawah dibiarkan memadat dan dimasukkan ke dalam kulkas. Setelah 15 menit, cawan petri dikeluarkan dan dibiarkan pada suhu ruang. Layer atas sebanyak 45 mL MHA steril dengan perlakuan sama seperti kontrol pertumbuhan diberi 2 mL suspensi bakteri Staphylococcus epidermidis. Selanjutnya layer atas dituang ke permukaan layer bawah yang telah memadat, lalu dibiarkan selama 1 jam pada suhu ruang hingga memadat.
Sumuran dilakukan dengan menggunakan pelubang sumuran diameter 6 mm sebanyak 9 lubang dalam 1 cawan petri. Sumuran hanya dilakukan pada layer atas dengan layer bawah sebagai dasar. Dalam cawan petri, ke dalam lubang sumuran diberi basis emulgel, kontrol positif, formula 1, formula 2, formula 3, formula 4, formula 5, formula 6 dan formula 7 sebanyak 0,2 mL dengan menggunakan spuit injeksi. Masing-masing formula dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Setelah itu cawan petri dibungkus plastik wrap dan inkubasi selama 24 jam dalam ruang inkubasi. Kemudian diukur zona hambat yang dihasilkan. 9. Penetapan Kadar
a. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan adalah campuran antara kloroform : metanol : etil asetat (28 : 1,75 : 3,5) (Yuliani, 2013). Fase gerak dituang ke dalam chamber dan kemudian dimasukkan kertas saring sebagai
indikator penjenuhan. Chamber ditutup rapat dan dibiarkan selama 1 jam sampai seluruh kertas saring terbasahi oleh fase gerak.
b. Pembuatan larutan baku alfa mangostin
Baku alfa mangostin yang telah ditimbang sebanyak 0,4862 mg dilarutkan menggunakan metanol ke dalam labu takar 5 mL sampai tanda batas. Sehingga larutan baku alfa mangostin yang diperoleh adalah 0,109724 mg/mL.
c. Pembuatan seri larutan baku alfa mangostin
Larutan baku alfa mangostin ditotolkan menggunakan autosampler dengan volume 1, 2, 4, 8, dan 16 μL pada lempeng silika gel F254 sehingga diperoleh seri larutan baku alfa mangostin 0,09724, 0,19448, 0,38896, 0,77792, dan 1,55584 μg.
d. Pembuatan larutan uji
Sebanyak 3 gram emulgel ditimbang dan dicampur dengan 5 mL HCl 1 M. Campuran selanjutnya dipindah ke dalam corong pisah dan diekstraksi dengan 20 mL kloroform, dilakukan sebanyak 2 kali. Fase bawah diambil dan diekstraksi kembali dengan 10 mL NaCl 5%. Fase bawah diambil lagi dan dimasukkan ke dalam cawan porselin yang sebelumnya telah ditimbang. Hasil ekstraksi diuapkan di atas heater sampai diperoleh ekstrak kental. Ektrak kental yang diperoleh kemudian dilarutkan menggunakan metanol ke dalam labu takar 5 mL sampai tanda batas. Larutan uji dibuat replikasi sebanyak 3 kali untuk tiap formula.
e. Penetapan kadar alfa mangostin emulgel antiacne ekstrak kulit buah manggis
Sebanyak 1 μL larutan uji ditotolkan pada fase diam silika gel F254 dengan menggunakan autosampler. Plat KLT selanjutnya dielusi sepanjang 8 cm dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak kloroform : metanol : etil asetat (28 : 1,75 : 3,5). Bercak diamati di bawah lampu UV 254 nm dan kemudian discanning pada panjang gelombang maksimal yaitu 319 nm (Yuliani, 2013). Puncak densitogram dan nilai AUC yang muncul diamati. Penetapan kadar dilakukan dalam 2 periode, yaitu 48 jam setelah emulgel dibuat dan setelah penyimpanan 1 bulan.
10. Uji iritasi HET-CAM
Telur ayam berembrio dibersihkan dan diinkubasi sampai berumur 9 atau 10 hari sehingga telur siap untuk diuji. Cangkang telur dibuka pada bagian bawah telur (tumpul) yang terdapat ruang udara. Kemudian membran dalam telur dibasahi dengan menggunakan larutan NaCl 0,9% hingga seluruh pembuluh darah terlihat. Dengan menggunakan pinset, membran dalam dibuang secara hati-hati sehingga memperlihatkan CAM. Sebanyak 0,3 gram basis emulgel, kontrol positif, kontrol negatif, formula 1, formula 2, formula 3, formula 4, formula 5, formula 6 dan formula 7 diletakkan di atas permukaan CAM. Setelah 20 detik, sediaan dibersihkan dengan larutan NaCl 0,9%. Kemudian telur diamati di bawah cahaya lampu selama 300 detik
untuk melihat efek yang terjadi pada permukaan CAM (lisis, hemoragi, dan koagulasi). Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali untuk tiap formula.