IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3. Penentuan Rasio Volume Xilanase dengan Eudragit TM
Bentuk Tidak terlarut
Bentuk Terlarut
A
: 3 dan 1 : 4. Hasil a
V
si dimana kese
ningkat. Sardar et al. (2000) memperlihatkan hasil spektroskopi
perubahan struktural yang signifikan, sebagai hasil amobilisa i dengan muatan protein yang berbeda terhadap matriksnya. Menurut Bosley dan Peilow
26 0 5 10 15 20 25 1 : 4 1 : 3 1 : 2 2 : 3 1 : 1 3 : 2 2 : 1 3 : 1 4 : 1 5 : 1 6 : 1
Rasio Volume Xilanase Ekstrak Kasar : Larutan EudragitTM S100 1% (b/v)
E fe k tiv it a s A m o b il is eraksi yang
Gambar 7. Pengaruh Rasio Volume Xilanase Ekstrak Kasar dengan Larutan EudragitTM S100 1 % (b/v) terhadap Efektivitas Amobilisasi
Peningkatan pada volume enzim (6 : 1) menurunkan efektivitas amobilisasi karena enzim yang mengumpul (crowding) mengurangi kesempatan bagi substrat molekul makro untuk menempel pada sisi aktif enzim. Fenomena sterik
t dan fluks produk. Laju transfer massa pada substrat dan produk menuju dan dari (2000) dalam Roy et al. (2004), pada muatan enzim yang sedikit, terdapat banyak permukaan matriks yang tersedia. Molekul enzim cenderung untuk memaksimalkan kontak dengan permukaan dan menyebabkan distorsi konformasi pada proses ini. Pada awalnya, molekul enzim akan menempati area dengan afinitas tinggi pada permukaan matriks, sehingga menimbulkan int
30 35 40 a s i ( % )
mendorong terjadinya kehilangan aktivitas yang lebih besar. Faktor-faktor ini selanjutnya akan berkurang sejalan dengan peningkatan konsentrasi enzim.
crowding di sekeliling situs aktif ini telah banyak dikaji dan umumnya memang banyak terjadi pada substrat molekuler makro seperti pada xilan (Sardar et al 2000). Hasil serupa pernah dilaporkan pada enzim amobil lain, yaitu papain (Hyndman et al. 1992), siklodekstrin glukositransferase (Abdel-Naby 1999) dan kitinase (Wang dan Chio 1998).
Berdasarkan hasil penentuan kondisi imobilisasi yang optimum pada matriks EudragitTM S100 (Lampiran 6 dan 7), diketahui bahwa xilanase amobil memiliki aktivitas yang lebih rendah dibandingkan xilanase bebas. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh limitasi/penghambatan difusional pada substra
matriks amobilisasi bukanlah suatu masalah bagi enzim bebas. Agar substrat dapat bereaksi dengan enzim amobil, substrat harus berdifusi masuk ke dalam matriks dan produk harus berdifusi keluar. Proses difusional pada enzim amobil ini seringkali menyebabkan konsentrasi substrat yang lebih rendah dan konsentrasi produk yang lebih tinggi pada situs aktif enzim dibandingkan pada larutan enzim bebas. Masalah difusional ini menjadi lebih signifikan pada substrat molekul makro, seperti xilan (Siso et al Meskipun aktivitas lebih rendah, tapi pengikatan matriks dengan enzim menggunakan EudragitTM S100 menunjukkan stabilitas enzim amobil terhadap pemaparan berulang dari beberapa siklus perubahan pH (Gambar 15).
Proses amobilisasi menyebabkan penurunan aktivitas xilanase menjadi
xilanase amobil. Dalam Sardar et al. (2000), data spektroskopi CD (Circular Dichr
ejauh ini dilaporkan lebih rendah dibandingkan denga
rubahan keadaan ion enzim dapat terjadi pada gugus asam amino yang berfungsi katalitik
. 1990).
23.97 %. Hal ini kemungkinan akibat terjadinya perubahan konformasi pada
oism) pada panjang gelombang 272 nm menunjukkan perubahan absorbansi yang drastis pada xilanase amobil dibandingkan xilanase bebas. Absorbansi sekitar 272 nm merefleksikan lingkungan mikro sekitar gugus asam amino pada protein dan mengkorelasikan faktor struktural dengan faktor efektivitas amobilisasi. Oleh karena itu, perubahan absorbansi tersebut menunjukkan perubahan konformasi yang disebabkan oleh proses adsorpsi pada amobilisasi.
Aktivitas xilanase amobil s
n enzim amobil lain (Roy et al. 1984, Abdel Naby 1993, Tyagi dan Gupta 1995).
4.4. Pengujian pH Optimum
Pengaruh pH terhadap aktivitas xilanase amobil diuji menggunakan dua jenis bufer dengan konsentrasi 0.02 M , yaitu bufer sitrat fosfat (pH 3.0 – 6.0) dan bufer fosfat (pH 6.0 – 7.0). Xilanase bebas menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 5.0 (0.861 nkat/ml) sedangkan pada xilanase amobil aktivitas tertinggi terjadi pada pH 6.0 (0.122 nkat/ml) dan selanjutnya menurun dengan meningkatnya pH (Lampiran 8).
Menurunnya aktivitas enzim karena perubahan pH yang tidak terlalu besar (sedikit dibawah atau diatas pH optimumnya) disebabkan oleh perubahan keadaan ion enzim, dan seringkali juga keadaan ion substrat. Pe
28 0 20 40 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 A kt ivi ta s X il a 60 R e 80 pH lat if
er enzim yang aktif. Penurunan aktivi
mengikat substrat, maupun pada gugus asam amino yang berfungsi mempertahankan struktur tersier dan kuarten
tas enzim dapat dipulihkan kembali dengan mengubah kondisi reaksi enzimatis pada pH optimumnya. Pada pH tertentu, perubahan muatan ion pada rantai samping dari gugus asam amino enzim yang dapat terionisasi menjadi terlalu besar sehingga mengakibatkan terjadinya denaturasi enzim yang disertai dengan hilangnya aktivitas katalitik enzim. Perubahan struktur tersier dapat menyebabkan kelompok hidrofobik (yang pada awalnya tersembunyi pada bagian dalam molekul enzim) mengalami kontak dengan air sehingga solubilitas enzim menjadi berkurang. Solubilitas enzim yang berkurang dapat mengakibatkan penurunan aktivitas enzim secara bertahap (Palmer 1981, Harper et al. 1984). 100 ( % ) n ase
Gambar 8. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Xilanase Amobil (simbol terbuka) dan Xilanase Bebas (simbol solid) Menggunakan Bufer Sitrat Fosfat 0.02 M (□) dan Bufer Fosfat 0.02 M (∆)
Xilanase Streptomyces sp. isolat 45I-3 menunjukkan aktivitas relatif yang berbeda pada pH 6.0 dalam larutan bufer sitrat fosfat dan bufer fosfat, yaitu masing-masing sebesar 82.04 % dan 71.59 % pada xilanase bebas sedangkan pada xilanase amobil sebesar 100 % dan 63.33 %, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8. Hal ini menunjukkan bahwa jenis bufer berpengaruh terhadap aktivitas xilanase. Pengaruh jenis bufer pada pH yang sama terhadap aktivitas xilanase juga dijumpai pada xilanase Cellulomonas flavigena dan Thermotoga
asetat meningkat sekitar tujuh kali lipat dibandingkan aktivitas xilanase dalam bufer MES, namun pada pH 5.5 aktivitas relatifnya hanya 20 % lebih tinggi. Aktivitas relatif xilanase dalam tiga jenis bufer (fosfat, Tris-HCl dan CHES) menunjukkan nilai yang berbeda (Zhengqiang 2001).
Perbedaan aktivitas dalam jenis bufer yang berbeda disebabkan perbedaan pK bufer, jenis dan jumlah muatan ion penyusun bufer. Setiap jenis bufer memiliki rentang pH tertentu dan kapasitas bufer dipengaruhi oleh pK-nya. Bufer akan bekerja baik pada daerah pH yang dekat dengan pK-nya sehingga semakin jauh dari p
erpengaruh pada konstanta dielektrik larutan dan jumlah muatan ion erpengaruh terhadap besarnya kekuatan ion larutan. Konstanta dielektrik dan ekuatan ion berpengaruh terhadap kecepatan reaksi enzimatis (Suhartono 989).
Amobilisasi xilanase tampaknya menyebabkan terjadinya perubahan pH optimum, yaitu pada xilanase bebas adalah pH 5.0, sedangkan pada xilanase amobil adalah pH 6.0 dengan menggunakan bufer sitrat fosfat 0.02 M. Hal ini diduga merupakan suatu efek dari amobilisasi yang dilakukan menggunakan matriks anionik. Penelitian Krajewska et al. (1990) menunjukkan bahwa perubahan pH optimum menjadi lebih asam untuk aktivitas katalitik dibandingkan enzim bebas (pH 6.5 menjadi 6.0) disebabkan oleh penggunaan matriks kationik yang bermuatan positif, sehingga akan mengubah pH optimum menjadi lebih
Naby 1993
sama, didu nelitian ini, yaitu pada matriks anionik yang bermuatan negatif akan mengubah kurva pH-aktivitas menjadi nilai pH y
maritima. Aktivitas xilanase Cellulomonas flavigena pada pH optimum 6.5 dalam bufer sitrat fosfat lebih tinggi 45 % dibandingkan dalam bufer Tris-HCl (Martinez- Trujilo et al. 2003). Aktivitas relatif xilanase Thermotoga maritima pada pH 5.0 dalam bufer
K maka kapasitas bufer-nya akan semakin menurun. Muatan ion b
b k 1
rendah. Observasi serupa juga telah dilaporkan untuk xilanase amobil lain (Abdel , Gouda dan Abdel-Naby 2002). Oleh karena itu, dengan prinsip yang ga hal yang sebaliknya terjadi pada pe
ang lebih tinggi. Selain itu, laporan Engasser dan Horvath (1976) menyebutkan bahwa amobilisasi enzim menyebabkan terjadinya efek partisi sehingga mengakibatkan perbedaan nilai pH optimum dan atau Km enzim amobil dibandingkan enzim bebas. Efek partisi ini disebabkan adanya interaksi elektrostatik atau interaksi lain antara matriks dengan enzim disebabkan konsentrasinya pada lingkungan mikro berbeda pada larutan reaksi.
30