PENETAPAN KADAR ALKALOID PIPERIN DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI
PENETAPAN KADAR FENOL TOTAL DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI
1. Kompetensi Dasar
S6 : Bekerja sama dan memiliki kepekaan sosial serta kepeduliaan terhadap masyarakat dna lingkungan
S9 : Menunjukkan sikap bertanggung jawab atas pekerjaan di bidang keahliannya secara mandiri
P5 : Mampu menerapkan ilmu dan teknologi kefarmasian dalam pengembangan sediaan farmasi bahan alam yang aman, berkhasiat dan bermutu
KU2 : Mampu menunjukkan kinerja mandiri, bermutu dan terukur
KU5 : Mampu mengambil keputusan secara tepat dalam konteks penyelesaian masalah dibidang keahliannya, berdasarkan hasil analisis informasi dan data
KK5 : Mampu mengisolasi serta mengidektifikasi senyawa metabolit sekunder Sebelum melakukan praktikum, mahasiswa harus sudah paham mengenai definisi, jenis dan cara ekstraksi fenol.
2. Indikator Capaian
M2 : Mampu melakukan identifikasi kandungan metabolit sekunder dari simplisia bahan alam (P5KU2)
3. Tujuan Praktikum
Setelah mengikuti praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat melakukan pengujian kuantitatif penetapan kadar fenol total dari ekstrak dengan menggunakan metode sederhana.
4. Uraian Teori
Istilah senyawa fenol digunakan untuk senyawa yang memiliki ciri adanya cincin aromatik dan satu atau dua gugus hidroksil. Oleh karena hal di atas, beberapa pustaka menggolongkan senyawa fenol ke dalam golongan senyawa aromatik. Senyawa fenol memiliki gugus hidroksil lebih dari dua disebut dengan
84
polifenol, sebagai contoh kelompok tanin, flavonoid, melanin, lignin (Hanani 2015)
Gambar 12.1. Struktur Fenol (Altivia Petrochemical 2015)
Senyawa fenol murni dapat menimbulkan rasa panas seperti terbakar jika bersentuhan dengan kulit. Hidrokuinon merupakan salah satu senyawa fenol yang penyebarannya dalam tumbuhan cukup luas. Fenol sederhana yang lain seperti orsinol, katekol, pirogalol, floroglusinol keberadaannya lebih terbatas. Fenol bebas relatif jarang terdapat pada tumbuhan, umumnya senyawa fenol berikatan dengan gula membentuk glikosida yang lebih mudah larut dalam air. Senyawa fenol dengan protein membentuk kompleks (melalui ikatan yang dapat mengakibatkan kerja enzim terhambat). Sering kali proses ekstraksi tidak berhasil dilakukan untuk memperoleh senyawa fenol karena kepekaannya terhadap enzim oksidase, seperti fenolase. Oleh pengaruh cahaya dan udara warna senyawa fenol secara perlahan menjadi gelap. Fungsi senyawa fenol terhadap tumbuhan yang sudah diketahui adalah sebagai pembangun dinding sel, pigmen bunga dan enzim. (Hanani 2015).
Mekanisme kerja dari penetepan kadar fenolik total menggunakan reagen Folin-Ciocalteu adalah terbentuknya senyawa kompleks berwarna biru yang dapat diukur pada panjang gelombang maksimum. Pereaksi ini mengoksidasi fenolat (garam alkali) atau gugus fenolik-hidroksi mereduksi asam heteropoli (fosfomolibdat-fosfotungstat) menjadi kompleks molibdenum-tungsten.
Semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan merduksi asam heteropoli (fosfomolibdat-fosfotungstat) menjadi kompleks molibdenum-tungsten sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat. Senyawa fenolik bereaksi dengan reagen Folin Ciocalteu hanya dalam suasana basa agar terjadi disosiasi proton pada senyawa fenolik menjadi ion fenolat. Untuk membuat kondisi basa digunakan Na2CO3 10%.
85
Penetapan kadar fenol dalam simplisia umumnya ditentukan menggunakan pereaksi Folin Ciocalteu yang menghasilkan kadar fenol total. Sebagai pembanding dapat digunakan asam galat sehingga kadar fenol total dinyatakan setara dengan asam galat. Absorbsi diukur pada panjang gelombang 760 nm. (Hanani 2015).
5. Pelaksanaan Praktikum a. Alat dan Bahan
Alat : Peralatan yang digunakan adalah blender, alat-alat gelas, timbangan analitik, alumunium foil, deksikator, mikropipet, spektrofotometer.
Bahan : Ekstrak, larutan Na2CO3 10%, Reagen folin ciocalteu, aquadest, asam galat, etanol 96%, metanol
b. Prosedur Kerja
1) Pembuatan Larutan Uji Konsentrasi
Timbang 50 mg ekstrak etanol daun katuk, kemudian dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml, volume dicukupkan dengan etanol : air (1:1) hingga tanda batas.
2) Pembuatan Larutan Na2CO3 7,5%
Sebanyak 7,5 g Na2CO3 ditambah 80 ml air suling, kemudian didihkan sampai serbuk Na2CO3 larut sempurna. Setelah itu diamkan selama 24 jam, disaring dan diencerkan dengan air suling sampai volume 100 ml (Alfian dan Susanti 2012).
3) Pembuatan Larutan Asam Galat
Sebanyak 10 mg asam galat dilarutkan dalam 0,1 ml etanol, kemudian diencerkan dengan air suling sampai volume 100,0 ml (Alfian dan Susanti 2012)
4) Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Asam Galat
Sebanyak 300 µL larutan asam galat konsentrasi 30 µg/ml ditambah 1,5 ml pereaksi Folin Ciocalteu (1:10), kemudian dikocok dan didiamkan selama 3 menit ke dalam larutan tersebut ditambah 1,2 ml larutan Na2CO3 7,5%, dikocok homogen dan diamkan pada suhu ruang kamar
86
kemudian absorbansinya diukur pada panjang gelombang 600-850 nm (Alfian dan Susanti 2012).
5) Penentuan Operating Time
Sebanyak 300 µL larutan asam galat konsentrasi 30 µg/ml ditambah 1,5 ml reagen Folin Ciocalteu, kemudian dikocok dan didiamkan selama 3 menit. Kedalam larutan tersebut ditambah 1,2 ml larutan Na2CO3 7,5%, dikocok homogen, dan diukur absorbansinya dalam rentang waktu 0-60 menit pada panjang gelombang maksimum (Alfian dan Susanti 2012). 6) Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Galat
Diambil 1,8 ml, 3 ml, 4,2 ml, 5,4 ml, 6,6 ml larutan asam galat dibuat dengan 5 konsentrasi yaitu 18, 30, 42, 54, dan 66 μg/ml menggunakan mikropipet dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian pada masing-masing konsentrasi ditambah 1,5 ml reagen Folin Ciocalteu (1:10) menggunakan mikropipet. Setelah didiamkan selama 3 menit, masing-masing larutan ditambah 1,2 ml larutan Na2CO3 7,5% menggunakan mikropipet dikocok homogen, dan didiamkan pada range operating time pada suhu kamar. Semua larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 765,5 nm, kemudian dibuat kurva kalibrasi hubungan antara konsentrasi asam galat (μg/ml) dengan absorbansi.
7) Penentuan Kandungan Fenolik Total
Sebanyak 50 mg ekstrak dari masing-masing sampel dilarutkan sampai volume 25 ml di labu ukur yang berbeda dengan campuran etanol : aquadest (1:1) hingga diperoleh konsentrasi 2000 ppm. Larutan ekstrak yang diperoleh dipipet 300 μL dan ditambah 1,5 ml reagen Folin Ciocalteu dan dikocok. Didiamkan selama 3 menit, ditambah 1,2 ml larutan Na2CO3 7,5% dan didiamkan lagi pada waktu 60 menit. Absorbansi larutan ekstrak diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 756,5 nm. Dilakukan 3 kali pengulangan (Murtijaya dan Lim 2007).
87 F= F×G×H*
Keterangan :
F = Kadar Total Fenolik
C = Konsentrasi asam galat (µg/ml) v = Volume total ekstrak
Fp = Faktor pengenceran m = Berat sampel (g)
6. Evaluasi
a. Hasil Percobaan
Hasil regresi linear kurva standar asam galat
No Konsentrasi Absorbansi Persamaan kurva
y=bx±a
88 Perhitungan kadar fenol total dalam ekstrak
89 b. Pembahasan
Pembahasan terhadap reaksi yang terjadi pada penetapan kadar fenol total dan bagaimana perhitungan kadar fenol total.
90 c. Kesimpulan
d. Laporan (lihat Pedoman Laporan Hasil Praktikum) 7. Soal Latihan
1. Asam galat digunakan sebagai apa dalam penetapan kadar fenol total? Jawab:
2. Perubahan warna apa yang terjadi pada penetapan kadar fenol total? Jawab:
3. Apa yang dimaksud dengan senyawa fenol? Jawab:
8. Daftar Pustaka
Departemen Kesehatan RI.(2000) Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta. Ditjen POM.
Hanani E. 2016. Analisis Fitokimia. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Hlm. 10-11, 65-67, 73.
Stahl E. (1985). Analisis obat secara kromatografi dan mikroskopi. Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Penerbit ITB Bandung.
BPOM RI. (2006). Monografi Ekstak Tumbuhan Obat Indonesia, volume 2. Aziz dkk. (2011). Standarisasi Obat bahan alam, Graha Ilmu,Yogyakarta. List PH dan Schmidt PC.(1989). Phytopharmaceutical technology. Boca Raton,
Florida: CRC Press Inc.
Robinson T. (1995). Kandungan organik tumbuhan tinggi. Edisi keenam. Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB. Wijesekera ROB. (2000). The Medicinal Plant Industry. Florida: CRC Press Inc.
91