Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Varians (Anova) pada
RAL. Selanjutnya data hasil Anova yang berpengaruh nyata diuji lanjut dengan uji Duncan's Multiple Range Test (DMRT). Semua kegiatan pengolahan data
dilakukan dengan menggunakan software SAS. Angka yang diikuti huruf yang
Metode Analisis Kadar Air (AOAC, 1995)
Sejumlah ± 5,0 g sampel dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui
beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 100 °C hingga
diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan dengan menggunakan rumus:
c-(a-b)
KA = x 100% c
Keterangan : a = Berat cawan dan sampel (g) b = Berat cawan dan sampel akhir (g) c = Berat sampel awal (g)
Kadar Asam Lemak Bebas (AOCS Official Method Ca 5a-40 1993)
Sampel sebanyak 7,05 ± 0,05 g dilarutkan dalam 75 ml alkohol 95% netral,
dipanaskan selama 10 menit dalam hot plate sambil diaduk, lalu ditambahkan 3-5
tetes indikator PP 1%. Setelah itu dititrasi dengan larutan standar NaOH 0,25 N hingga warna merah muda tetap. Asam lemak bebas dinyatakan sebagai persen asam lemak, dihitung sampai dua desimal dengan menggunakan rumus:
M x V x T Kadar ALB =
10 m
Keterangan : M = Bobot molekul asam lemak (256 untuk minyak sawit dan 205 untuk CNO)
V = Volume NaOH yang diperlukan dalam peniteran (ml) T = Normalitas NaOH
m = Bobot contoh (gram)
Bilangan Peroksida (AOCS Official Method Cd 8-53 1993)
Sampel sebanyak 5 ± 0,05 g dilarutkan dalam 30 ml campuran larutan dari asam asetat glasial dan kloroform (2:3). Lalu dilakukan penambahan larutan KI jenuh sebanyak 0,5 ml sambil dikocok dan 30 ml akuades. Selanjutnya titrasi dengan larutan standar natrium tiosulfat (Na2S2O3) 0,1 N dengan indikator pati
sehingga warna kebiruan berubah menjadi jernih. Blanko dibuat dengan cara yang sama. Bilangan peroksida dihitung dengan rumus:
(V1 – V0) x N x 8x 1000
Miligram oksigen per 100 gram = m
Keterangan : V1 = Volume larutan natrium tiosulfat untuk minyak (ml)
V0 = Volume larutan natrium tiosulfat untuk blanko (ml)
N = Normalitas larutan standar natrium tiosulfat yang digunakan
m = Bobot minyak (g)
8 = Setengah dari berat atom oksigen
Bilangan Iod (AOCS Official Method Cd 1-25 1993)
Sampel minyak sebanyak 0,5 g dalam erlenmeyer 500 ml, ditambahkan 20
ml larutan CCl4 dan 25 ml larutan Wijs, kemudian dicampur merata dan disimpan
dalam ruang gelap selama 30 menit pada suhu 25 °C. Selajutnya ditambahkan 20
ml larutan KI 15% dan 100 ml akuades, lalu dititrasi dengan larutan Na2S2O3
0,1N sampai larutan berwarna kekuningan. Setelah itu ditambahkan indikator pati dan dititrasi kembali sampai warna biru hilang. Blanko dibuat dengan cara yang sama tanpa menggunakan minyak. Bilangan iod dinyatakan sebagai gram iod yang diserap per 100 gram dihitung sampai dua desimal dengan menggunakan rumus:
12,69 x T (V3 – V4)
Bilangan Iod =
m
Keterangan: T = Normalitas larutan standar natrium tiosulfat 0,1 N V3 =Volume larutan natio 0,1 N blanko (ml)
V4 =Volume larutan natio 0,1 N sampel (ml)
12,69 = Berat atom iod m = Berat sampel (g)
Komposisi M-DAG (modifikasi Gunstone et al. 1994)
Analisis komposisi M-DAG dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) atau Thin Layer Chromatography (TLC). Sebanyak 100 mg sampel
dilarutkan dalam 0,1 ml kloroform. Sebanyak 1 μm larutan diaplikasikan pada
lempeng TLC dalam bentuk spot bulat dengan jarak antar spot adalah 2 cm. Lempeng TLC dielusi menggunakan campuran pelarut petroleum eter : dietil eter : asam asetat glasial yang telah dijenuhkan sebelumnya. Setelah elusi dilakukan selama ± 1,5 jam, lempeng dikeluarkan dari bejana pengembang dan dibiarkan beberapa menit sampai uap yang masih tertinggal hilang.
Identifikasi yang dilakukan adalah pewarnaan dengan larutan fluoresens seperti Rhodamine 6G atau 2’, 7’-dichlorofluorescein yang disemprotkan pada lempeng kemudian spot yang terbentuk dilihat di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 256 nm. Spot yang telah terbentuk diberi tanda kemudian diplotkan ke dalam kertas pemetaan (kalkir).
Slip Melting Point (SMP) (AOCS Official Method Cc 3-25 1993)
Pipa kapiler yang berdiameter 1 mm dan panjang 10 cm dicelupkan ke dalam sampel minyak yang sudah dipanaskan setinggi ± 1 cm, lalu bagian luar pipa kapiler dibersihkan dengan tisu. Pipa kapiler disimpan di dalam refrigerator
(suhu 4-10 °C) selama 16 jam (semalaman). Kemudian dipasangkan pada
termometer dengan diikat karet sejajar dengan ujung termometer. Termometer dicelupkan ke dalam gelas piala diatas hot plate berisi air dengan suhu 8-10 °C
dibawah SMP sampel. Hot plate dinyalakan dengan kenaikan suhu 1 °C per
menit. Air dalam gelas piala akan naik suhunya, pada suhu tertentu sampel minyak dalam kapiler akan mencair ditandai dengan meluncur naiknya sampel. Selang suhu termometer saat sampel minyak mulai naik sampai sampel minyak berada diatas batas 1 cm dicatat.
Total Karotenoid (PORIM p2.6 1995)
Sampel dilelehkan dan dihomogenisasi. Kemudian sampel sebanyak 0,1 g dilarutkan dengan heksan p.a. ke dalam labu takar 25 ml sampai tanda tera, lalu dikocok hingga benar-benar homogen. Selanjutnya absorbansi diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 446 nm. Total karotenoid dihitung dengan menggunakan rumus:
25 x 383 x absorbansi Total karotenoid (ppm) = Berat sampel (g) x 100
Sifat Kristalisasi Lemak (Narine dan Marangoni 1999)
Sifat kristalisasi lemak campuran sebelum dan setelah interesterifikasi enzimatik diamati dengan mikroskop polarisasi cahaya (Olympus BH-2). Sampel
dipreparasi dengan dilelehkan pada suhu 80 °C dan diteteskan pada gelas objek
lalu ditutup dengan cover glass yang sebelumnya juga telah dipanaskan pada suhu
80 °C. Lalu sampel disimpan di refrigerator bersuhu 4 °C selama ± 1 jam. Hal ini dilakukan agar sampel telah mengalami kristalisasi yang baik saat diamati.
Kemudian rata-rata ukuran kristal lemak diukur dengan cara menjumlahkan diameter semua kristal lemak dalam satu bidang pandang lalu dibagi jumlah kristal. Satu perlakuan diamati dengan 10 kali bidang pandang. Fotomikrograf diambil pada perbesaran 400 kali.
Solid Fat Content (SFC) (Anonymous 1999)
Pengukuran SFC dilakukan menggunakan alat nuclear magnetic resonance
(NMR) Bruker Minispec PC 100 NMR Analyzer. Pre-treatment atau prosedur
stabilisasi sangat menentukan jumlah dan tipe kristal lemak yang terbentuk, dan
konsekuensinya terhadap kandungan solid (solid content) yang diukur dengan
NMR. Prosedur stabilisasi dan tempering untuk pengukuran SFC margarin, sesuai
dengan yang dikeluarkan oleh Bruker (Typical Applications for Food Industry:
Minispec Application Note 8).
Sampel diisikan ke dalam tabung NMR setinggi ± 2,5 cm. Sebelum
dianalisis, sampel dipanaskan pada suhu 80 °C agar meleleh sempurna untuk
meyakinkan homogenitasnya. Kemudian sampel yang telah meleleh
dipertahankan pada suhu 60 °C selama 5 menit. Selanjutnya sampel disimpan
dulu pada masing-masing suhu pengukuran yaitu 10, 20, 25, 30, 35, 40 °C selama 30-35 menit.
Analisis Komposisi Asam Lemak(AOCS Official Method Ce 1-62 1993)
Semua sampel kecuali CNO diekstraksi lemaknya terlebih dahulu dengan
menggunakan metode Folsch. Sampel ditimbang ± 0,5 g dalam erlenmeyer 100
ml. Kemudian ditambahkan larutan standar internal asam margarat (1,0 mg asam margarat dalam 1,0 ml heksan) sebanyak 8 sampai 10 mg. Ditambahkan kloroform dan metanol (2:1) sebanyak 20 ml, kemudian distirrer minimal 1 jam. Sampel disaring dengan kertas Whatman lalu ditambahkan NaCl 0,88% sebanyak 4 ml ke dalam filtrat lalu di vorteks. Setelah terbentuk 2 fase dimana fase atas adalah fase air dan protein, sedangkan fase bawah merupakan lemaknya, fase atas dibuang dengan pipet. Fase bawah disaring lagi dengan natrium tiosulfat untuk menyerap air yang masih tersisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup ulir.
Kemudian sampel dihembus atau dipekatkan dengan gas N2 untuk menguapkan
pelarutnya.
Setelah sampel diekstrak, dilakukan preparasi metil ester asam lemak
menggunakan metode BF3-metanol. Pada prinsipnya trigliserida disabunkan untuk
membebaskan asam-asam lemak, yang kemudian diesterifikasi dengan metanol
menggunakan bantuan katalisator BF3 (boron trifluoroda). Untuk kuantifikasi
digunakan standar internal asam margarat (C17).
Sampel hasil ekstraksi dalam tabung reaksi bertutup ulir, ditambahkan ± 1,5
ml NaOH 0,5 N dalam metanol, dihembus dengan gas N2, selanjutnya dipanaskan
dalam penangas air pada suhu 100 °C selama 5 menit untuk melarutkan lemak
agar tercampur lebih merata dalam larutan, kemudian didinginkan dengan air mengalir.
Ditambahkan 2 ml BF3-metanol 14% b/v dan dihembus dengan gas N2,
dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100 °C selama 30 menit, kemudian
didinginkan pada suhu 30-40 °C. Ditambahkan 1 ml heksan, dihembus gas N2
lalu divorteks selama 30 detik. Selajutnya ditambahkan 15 ml NaCl jenuh guna menyempurnakan pencampuran metil ester dalam metanol dan heksan, divorteks kemudian dibiarkan sehingga terpisah menjadi dua fase. Lapisan atas (asam lemak
dalam heksan) diambil dengan pipet kemudian dimasukkan dalam tabung vial berisi Na2SO4 anhidrat.
Metil ester siap diinjeksi pada Gas Chromatography (GC). Identifikasi
Asam Lemak (AL) menggunakan alat kromatografi (GC-9AM) dengan kolom kapiler DB.23P/N 122-2332 (30 m, diameter dalam 0,25 mm). Temperatur terprogram (120 °C selama 6 menit dengan kenaikan 30 °C/menit sampai 230 °C),
Flame Ionization Detector (FID) dengan gas pembawa Helium 1 mmHg.
Perhitungan Response Factor (RF) dengan menggunakan standar eksternal
yang disuntik yaitu Standar FAME (Fatty Acid Metil Ester), dengan
menggunakan rumus: Area C17 x mg Al RF = Area AL x mg C17 Area AL x mg C17 x RF mg AL/100 g bahan = Area C17 x g sampel
