B. Kompetisi L rhamnosus R21 dengan S Typhimurium
4. Pengaruh kompetisi terhadap S Typhimurium dan L rhamnosus R21
Adanya kompetisi oleh BAL L. rhamnosus R21 dengan jumlah awal 109 CFU/mL dapat menghambat S. Typhimurium baik pada suhu rekonstitusi 27, 60, maupun 70 oC. Hal ini dapat dilihat dari peningkatan jumlah S. Typhimurium setelah 8 jam hang time masing-masing hanya 0.66, 0.07, dan 1.05 log CFU/mL. Nilai tersebut lebih rendah dibandingkan dengan peningkatan jumlah Salmonella Typhimurium kontrol pada suhu rekonstitusi yang sama, yaitu masing-masing 4.50, 4.03, dan 4.21 log CFU/mL. Dengan demikian terjadi penghambatan S. Typhimurium > 3 siklus log, masing-masing sebesar 3.84, 3.96, dan 3.16 log CFU/mL. Perbedaan suhu rekonstitusi (27, 60, dan 70 oC) menghasilkan tingkat penghambatan terhadap S. Typhimurium yang berbeda pula, namun tidak signifikan (p-value > 0.05; Lampiran 9g). Artinya, pada perlakuan jumlah awal 109 CFU/mL, Lactobacillus rhamnosus R21 yang direkonstitusi pada suhu 70 oC masih efektif menghambat Salmonella selama 8 jam hang time (Tabel 7).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 2 4 6 8 pH Jum lah s e l ( Lo g CF U/m L)
Hang Time (jam)
S.Typhimurium (kontrol) S.Typhimurium (kompetisi) L. rhamnosus R21 (kompetisi) L. rhamnosus R21 (kontrol)
Tabel 7. Jumlah dan penurunan S. Typhimurium pada kompetisi dengan L. rhamnosus R21 setelah hang time selama 8 jam Jumlah awal BAL (CFU/mL) Perlakuan Suhu (oC) ∑ ST (0 jam) (No) Log (CFU/mL) ∑ ST (8 jam) (Nt) Log (CFU/mL) Pertumbuhan (Nt-No) Penghambatan*) Log (CFU/mL) ∆pH 109 ST vs R21 27 4.14 4.80 0.66 -3.84**)a -1.58a 109 ST vs R21 60 4.46 4.53 0.07 -3.96a -1.30a 109 ST vs R21 70 3.48 4.53 1.05 -3.16a -1.48a - Kontrol ST 27 4.36 8.86 4.50 0b - Kontrol ST 60 4.08 8.11 4.03 0b - Kontrol ST 70 3.09 7.30 4.21 -0.04b 108 ST vs R21 70 2.58 5.71 3.13 -0.51b -0.36c - Kontrol ST 70 2.85 6.49 3.64 -0.03b 106 ST vs R21 70 3.05 6.04 2.99 -0.23b 0.1***)d - Kontrol ST 70 2.80 6.02 3.22 0.1d
Keterangan: ST = Salmonella Typhimurium R21 = Lactobacillus rhamnous R21
*)
Nilai penghambatan dihitung berdasarkan selisih tingkat pertumbuhan S. Typhimurium kompetisi dengan kontrol S. Typhimurium untuk pada suhu rekonstitusi yang sama.
**)
Nilai negatif berarti terjadi penghambatan
***)
Nilai positif berarti tidak terjadi penurunan pH setelah hang time Superscripthuruf sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada α 0.05
38 Tabel 8. Jumlah dan penurunan L. rhamnosus R21 pada kompetisi dengan S. Typhimurium setelah hang time selama 8 jam
Jumlah awal BAL (CFU/mL) Perlakuan Suhu (oC) ∑ R21 (0 jam) (No) Log (CFU/mL) ∑ R21 (8 jam) (Nt) Log (CFU/mL) Pertumbuhan (Nt-No) Penghambatan*) Log (CFU/mL) ∆pH 109 R21 vs ST 27 8.86 9.41 0.55 -0.13a -1.58a R21 vs ST 60 9.20 9.42 0.22 -0.95b -1.30a R21 vs ST 70 9.06 9.42 0.36 0.11**)a -1.48a Kontrol R21 27 8.85 9.53 0.68 -1.56a Kontrol R21 60 9.23 10.40 1.17 -1.38a Kontrol R21 70 9.08 9.33 0.25 -1.58a 108 R21 vs ST 70 7.98 8.26 0.28 -0.92 b -0.36b Kontrol R21 70 7.78 8.98 1.20 -0.34b 106 R21 vs ST 70 5.43 6.04 0.61 -0.24 a,b 0.1***)c Kontrol R21 70 4.61 5.46 0.85 0.1c
Keterangan: *) Nilai penghambatan dihitung berdasarkan selisih pertumbuhan kontrol L. rhamnosus R21 dengan L. rhamnosus R21 kompetisi pada suhu rekonstitusi yang sama
**)
Nilai positif berarti tidak terjadi penghambatan
***)
Nilai positif berarti tidak terjadi penurunan pH setelah hang time Superscript huruf sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada α 0.05
Perbedaan ∆ pH antara S. Typhimurium kompetisi dan kontrol setelah hang time menunjukkan peranan pH terhadap penghambatan S. Typhimurium. Pada kompetisi dengan BAL terjadi penurunan pH sebesar 1.58 (rekonstitusi 27 oC), 1.30 (rekonstitusi 60 oC), dan 1.48 (rekonstitusi 70 oC). Hal tersebut menandakan bahwa pada kompetisi dengan S. Typhimurium, BAL tetap aktif dan menghasilkan asam. Sementara pada kondisi tanpa kompetisi (ST kontrol) tidak terjadi penurunan pH (∆ pH≈0) (Tabel 7).
Penghambatan L. rhamnosus R21 terhadap S. Typhimurium berhubungan erat dengan kemampuannya untuk berkompetisi dalam memperoleh nutrisi dan menghasilkan komponen antimikroba. Menurut Cox (2000), bakteri dari genus Salmonella tidak mampu berkompetisi secara baik dengan mikroba lain yang umum terdapat pada makanan, termasuk BAL. Oleh karena itu, pertumbuhan S. Typhimurium akan terhambat oleh keberadaan bakteri-bakteri tersebut. Hasil metabolisme BAL yang mempunyai aktivitas antimikroba meliputi asam-asam organik (asam laktat, asam asetat, dan asam propionat), diasetil, hidrogen peroksida, karbondioksida, dan bakteriosin (Ouwehand dan Vesterlund 2004).
Komponen metabolit L. rhamnosus R21 yang berperan penting menghambat S. Typhimurium diduga kuat adalah asam laktat. Isolat L. rhamnosus R21 teridentifikasi sebagai salah satu Lactobacillus homofermentatif dimana hasil utama fermentasinya adalah asam laktat (Hartanti 2007). Adanya akumulasi asam laktat menyebabkan pH susu menurun setelah 8 jam hang time. Dengan jumlah awal BAL 109 CFU/mL, nilai rata-rata pH sesaat setelah rekonstitusi (jam ke-0) adalah 6.2 kemudian menurun menjadi rata-rata 4.7 pada jam ke-8 (Lampiran 7). Di bawah pH 5.0, asam laktat dapat bersifat bakterisidal terutama terhadap bakteri gram negatif (Ray dan Bhunia 2007). Molekul asam laktat dalam bentuk yang terdisosiasi di luar sel bakteri dapat merusak struktur dinding dan membaran sel bakteri. Hal ini terjadi pada kisaran pH 5-8. Sedangkan pada bentuk yang tidak terdisosiasi, molekul asam laktat bersifat lipofilik sehingga dapat menembus membran sel mikroba dengan mudah. Di dalam sel, asam laktat akan terdisosiasi dan mengacaukan metabolisme sel mikroba. Akibatnya, pertumbuhan mikroba menjadi terhambat (Ray dan Bhunia 2007).
Kemampuan L. rhamnosus R21 untuk menghambat S. Typhimurium dipengaruhi oleh jumlah awalnya. L. rhamnosus R21 dengan jumlah yang lebih rendah, yaitu 108 CFU/mL tidak efektif lagi menghambat S. Typhimurium pada suhu rekonstitusi 70 oC. Dengan perlakuan ini, penghambatan Salmonella Typhimurium hanya 0.51 log (<1 siklus log). Nilai tersebut tidak cukup signifikan untuk mengindikasikan adanya penghambatan terhadap S. Typhimurium karena pertumbuhan Salmonella Typhimurium kompetisi dan kontrol selama hang time tidak berbeda signifikan, yaitu 3.13 dan 3.64 log CFU/mL (p-value > 0.05; Lampiran 9h). Rendahnya penghambatan terhadap Salmonella Typhimurium juga terlihat dari kecilnya perbedaan ∆ pH kompetisi dan kontrol setelah hang time, yaitu masing-masing 0.36 dan 0.03.
Dengan jumlah awal BAL 106 CFU/mL, tingkat penghambatan S. Typhimurium menjadi semakin rendah, yaitu 0.23 log CFU/mL yang merupakan nilai terendah diantara semua perlakuan (Tabel 7). Berdasarkan uji statistik, tingkat pertumbuhan S. Typhimurium kontrol dan kompetisi pada perlakuan ini tidak berbeda signifikan, yaitu masing-masing 2.99 dan 3.22 log CFU/mL (p- value > 0.05; Lampiran 9i). Artinya, tidak terjadi penghambatan terhadap S. Typhimurium pada kompetisi dengan BAL 106 CFU/mL. Pada perlakuan ini tidak terjadi penurunan pH setelah hang time. Hal ini menunjukkan BAL tidak tumbuh dan tidak pula menghasilkan asam laktat. Kondisi ini dapat mengurangi hambatan terhadap S. Typhimurium. Di sisi lain pertumbuhan L. rhamnosus R21 sedikit terhambat. Nilai penghambatan terhadap Lactobacillus rhamnosus R21 pada perlakuan ini, yaitu 0.24 log CFU/mL (Tabel 8). Dengan demikian, pada perlakuan ini
40 penghambatan terhadap S. Typhimurium setara dengan penghambatan terhadap Lactobacillus rhamnosus R21.
Penghambatan S. Typhimurium oleh BAL berkorelasi positif dengan tingkat penurunan pH (∆ pH). Berdasarkan data Tabel 8, semakin tinggi penurunan pH, penghambatan terhadap S. Typhimurium semakin tinggi pula. Nilai penurunan pH dipengaruhi oleh jumlah BAL pada jam ke-0 dimana semakin tinggi jumlah BAL maka selisih pH jam ke-8 dan jam ke-0 makin tinggi. Pada rekonstitusi 70 oC dengan jumlah awal BAL 109 CFU/mL, terjadi penurunan pH kompetisi sebesar 1.48 sehingga Salmonella Typhimurium dapat dihambat sebanyak 3.16 log. Sedangkan dengan jumlah awal BAL 108 CFU/mL, penurunan pH kompetisi hanya 0.36, sehingga penghambatan S. Typhimurium lebih rendah, yaitu 0.51 log. Dengan jumlah awal 106 CFU/mL BAL tidak menyebabkan penurunan pH sehingga penghambatan terhadap S. Typhimurium tidak terjadi.
Rendahnya penghambatan S. Typhimurium pada kompetisi dengan BAL 108 dan 106 CFU/mL dapat disebabkan oleh beberapa faktor terkait BAL L. rhamnosus R21 maupun S. Typhimurium. Faktor dari BAL, antara lain kultur BAL probiotik lebih mudah mengalami stress pada jumlah di bawah 109 CFU/mL sehingga efek positif yang diberikan kurang efektif (Ray dan Bhunia 2007). Pada penelitian ini suhu rekonstitusi 70 oC berpotensi menyebabkan stress pada BAL. Dengan jumlah < 109 CFU/mL, BAL juga memiliki tingkat asidifikasi yang rendah dimana dalam waktu 8 jam sedikit sekali menghasilkan asam laktat yang merupakan komponen antimikroba utama. Berdasarkan penelitian Puspawati (2008), L. rhamnosus R21 dengan viabilitas 108 CFU/mL tidak menurunkan pH susu skim secara setelah 10 jam. Selain itu, BAL memerlukan nutrisi yang lebih kompleks dibandingkan Salmonella Typhimurium. Susu formula merupakan media yang kaya nutrisi, akan tetapi susu mengandung sedikit peptida dan asam amino bebas yang merupakan faktor pertumbuhan esensial bagi BAL (Vasiljevic et al. 2005). Hal ini diduga menyebabkan L. rhamnosus R21 memerlukan waktu yang lebih lama untuk tumbuh dengan normal setelah mengalami stress.
Keunggulan yang dimiliki S. Typhimurium, yaitu kemampuannya untuk bertahan pada kondisi stress. Meskipun S. Tyhimurium sensitif terhadap panas, bakteri ini tampak memiliki kemampuan yang lebih baik untuk pulih dari stress akibat rekonstitusi suhu 70 oC dibandingkan Lactobacillus rhamnosus R21 sehingga S. Typhimurium dapat tumbuh lebih cepat. Di sisi lain, Salmonella serovar (termasuk serovar Typhimurium) relatif tahan terhadap peningkatan konsentrasi asam karena mampu memproduksi sejumlah besar protein tertentu yang membuatnya tahan asam. Hal ini didukung oleh pernyataan Bearson et al. (2006), bahwa S. Typhimurium memiliki sejumlah gen yang berperan penting dalam menginduksi respon terhadap asam atau ATR (Acid Tolerance Response). Selain asam laktat, BAL juga menghasilkan komponen antimikroba lain, yaitu bakteriosin. Namun, bakteri gram negatif seperti Salmonella umumnya resisten terhadap bakteriosin dari BAL (Ray dan Bhunia 2007).
Berdasarkan data pada Tabel 8, diketahui bahwa pada kompetisi dengan S. Typhimurium, Lactobacillus rhamnosus R21 dengan jumlah awal 109 CFU/mL tidak mengalami pertumbuhan yang signifikan baik pada suhu rekonstitusi 27, 60, maupun 70 oC (Tabel 10). Tingkat pertumbuhan Lactobacillus rhamnosus R21 pada perlakuan ini, yaitu 0.55 log (rekonstitusi 27 oC), 0.22 log (rekonstitusi 60 oC), dan 0.36 log (rekonstitusi 70 oC). Hal ini menunjukkan bahwa pada kompetisi dengan S. Typhimurium, perbedaan suhu rekonstitusi tidak berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan L. rhamnosus R21 (p-value > 0.05; Lampiran 9j). L. rhamnosus R21 tidak tumbuh signifikan disebabkan konsentrasi biomassa BAL yang sudah cukup tinggi sehingga laju
41 pertumbuhan menjadi konstan dimana penambahan jumlah sel sebanding dengan jumlah sel yang mati (Pelczar et al. 2005).
Pada kompetisi dengan suhu rekonstitusi 70 oC, jumlah awal L. rhamnosus R21 tidak berpengaruh terhadap pertumbuhannya. Dengan jumlah awal 108 dan 106 CFU/mL, BAL juga tidak mengalami peningkatan jumlah yang signifikan setelah hang time, yaitu 0.28 dan 0.61 log CFU/mL (Tabel 8). Hal ini mungkin disebabkan sebagian besar sel BAL mengalami stress akibat heat shock ketika direkonstitusi pada suhu 70 oC. Sel yang mengalami stress cenderung tidak tumbuh untuk periode tertentu hingga sel kembali normal (Ray dan Bhunia 2007).
Kompetisi dengan S. Typhimurium tidak menghambat pertumbuhan Lactobacillus rhamnosus R21 secara signifikan selama hang time hingga 8 jam. Fenomena tersebut terjadi baik pada suhu rekonstitusi 27 oC, 60 oC, maupun 70 oC dengan jumlah awal BAL 109 CFU/mL. Penghambatan L. rhamnosus R21 terbesar hanya 0.95 log CFU/mL pada suhu rekonstitusi 60 oC, sedangkan pada suhu 70 oC tidak terjadi penghambatan pertumbuhan L. rhamnosus R21. Kompetisi dengan S. Typhimurium pada suhu rekonstitusi 70 oC juga tidak menyebabkan penghambatan yang signifikan terhadap L. rhamnosus R21, baik dengan jumlah awal BAL 109, 108, maupun 106 CFU/mL. Hal ini didasarkan pada pertumbuhan L. rhamnosus R21 kompetisi yang tidak berbeda nyata dengan kontrol (p-value > 0.05; Lampiran 9j).
C.Evaluasi kemampuan
L. rhamnosus R21 untuk menurunkan pH setelah
rekonstitusi
Susu formula bubuk merupakan bahan pangan yang memiliki nilai pH 6.6-6.8 (Skanderby et al. 2009). Adanya kultur BAL L. rhamnosus R21 berpengaruh terhadap pH susu selama hang time disebabkan kemampuan BAL untuk menghasilkan asam laktat. Perubahan pH susu rekonstitusi pada tiap perlakuan ditampilkan pada Tabel 9. Nilai yang ditampilkan dalam gambar tersebut adalah nilai pH yang terukur sesaat setelah susu direkonstitusi (jam ke-0) dan setelah susu mencapai 8 jam hang time.
Asam organik khususnya asam laktat merupakan produk fermentasi laktosa oleh BAL yang bersifat bakteriostatik dan bakterisidal. Akumulasi asam laktat dapat menurunkan pH sitoplasma yang berakibat pada turunnya laju sintesis makromolekul dan memengaruhi perpindahan senyawa melalui membran sel (Ouwehand 2004). Dengan cara ini, BAL dapat berkompetisi dengan bakteri lain yang ada di sekitarnya bahkan cenderung menghambat pertumbuhan bakteri tersebut. Adanya asam laktat di dalam susu dapat diketahui dengan mengukur penurunan pH susu selama hang time. BAL L. rhamnosus R21 memiliki keunggulan dibandingkan dengan S. Typhimurium, yaitu lebih tahan dengan kondisi asam. Hal ini dibuktikan oleh penelitian Hartanti (2007) dimana pada pH 2, penurunan L. rhamnosus R21 hanya berkisar 0.04-1.1 log CFU/mL. Sebaliknya, pertumbuhan Salmonella Typhimurium cenderung terhambat dengan adanya asam laktat yang dihasilkan oleh BAL (Nousiainen et al. 2003).
Data tingkat penurunan pH susu pada tahap ini dapat digunakan untuk memperkirakan kemampuan BAL untuk menghasilkan asam laktat pada suhu rekonstitusi yang berbeda (27, 60, dan 70 oC) dan efektifitas BAL dalam menghambat pertumbuhan S. Typhimurium. Berdasarkan data pada Tabel 9, untuk kontrol maupun kompetisi, jumlah awal BAL berkorelasi positif dengan penurunan pH dimana semakin tinggi jumlah awal BAL maka penurunan pH juga semakin tinggi. Pada suhu rekonstitusi 70 oC, kompetisi dengan S. Typhimurium tidak berpengaruh signifikan terhadap penurunan pH (p-value > 0.05; Lampiran 9k).
42 Tabel 9. Perubahan pH susu dengan jumlah awal BAL 109, 108, dan 106 CFU/mL pada kontrol dan
kompetisi dengan S. Typhimurium setelah 8 jam hang time
Perlakuan ∑ awal BAL (CFU/mL) Suhu rekonstitusi (oC) pH ∆ pH*) Jam ke-0 Jam ke-8
Kontrol 109 27 6.36 4.80a -1.56 109 60 5.99 4.61a -1.38 109 70 6.04 4.46a -1.58 108 27 7.14 6.54b -0.60 108 60 7.06 6.77b,c -0.29 108 70 6.90 6.56b -0.34 106 27 7.16 7.07b,c -0.09 106 60 7.14 7.29c 0.15**) 106 70 7.19 7.28c 0.09 Kompetisi 109 27 6.38 4.80a -1.58 109 60 6.04 4.74a -1.30 109 70 6.06 4.58a -1.48 108 70 6.88 6.52b -0.36 106 70 7.16 7.26c 0.10 Keterangan:
*) ∆ pH adalah selisih pH pada jam ke-8 dengan jam ke-0 **)
Nilai positif artinya tidak terjadi penurunan nilai pH
Superscripthuruf sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada α 0.05
Dengan jumlah awal 109 CFU/mL, BAL dapat menurunkan pH sejak awal hang time baik pada rekonstitusi suhu 27, 60, maupun 70 oC. Setelah 2 jam, pH sudah turun hingga 5.78 (27 oC), 5.59 (60 oC), dan 5.58 (70 oC). Pada nilai pH tersebut, susu formula tidak lagi layak dikonsumsi oleh bayi. Pada kompetisi dengan S. Typhimurium, nilai pH akhir susu (jam ke-8) dengan jumlah awal BAL 109 CFU/mL, yaitu 4.8 (suhu rekonstitusi 27 oC), 4.74 (suhu rekonstitusi 60 oC), dan 4.58 (suhu rekonstitusi 70 oC). Pada rentang pH tersebut, Salmonella Typhimurium tidak dapat tumbuh dengan baik sehingga jumlah S. Typhimurium setelah 8 jam hang time diduga cukup rendah. Artinya, BAL L. rhamnosus R21 dapat menghambat Salmonella Typhimurium secara efektif.
Pada kompetisi dengan suhu rekonstitusi 70 oC, BAL yang berjumlah awal 108 CFU/mL hanya dapat menurunkan pH sampai 6.52 pada jam ke-8. Nilai tersebut tidak jauh berbeda dengan kontrol, yaitu 6.85. Nilai pH sekitar 6.5-6.8 sesuai untuk pertumbuhan Salmonella Typhimurium (Bell dan Kyriakides 2002). Sehingga, pada perlakuan ini penghambatan Salmonella Typhimurium tidak efektif. Hal serupa juga diperkirakan terjadi pada suhu rekonstitusi 27 dan 60 oC. Hal ini didasarkan pada hasil pengukuran pH BAL kontrol setelah 8 jam, yaitu 6.54 (rekonstitusi 27 oC) dan 6.77 (rekonstitusi 60 oC).
Kompetisi dengan jumlah awal BAL 106 CFU/mL pada suhu rekonstitusi 70 oC bahkan tidak menurunkan pH susu formula selama 8 jam hang time. Nilai pH setelah hang time, yaitu 7.26. Kondisi yang demikian tentu cocok untuk pertumbuhan S. Typhimurium, sehingga diperkirakan jumlah BAL 106 CFU/mL juga tidak menghambat S. Typhimurium secara efektif. Pada BAL kontrol dengan jumlah awal 106 CFU/mL, nilai rata-rata pH akhir susu kontrol BAL juga diatas 7, yaitu 7.07 (rekonstitusi 27 oC), 7.29 (rekonstitusi 60 oC), dan 7.28 (rekonstitusi 70
43 o
C). Dengan demikian, pada rekonstitusi 27 maupun 60 oC, diperkirakan L. rhamnosus R21 juga tidak cukup efektif menghambat S. Typhimurium selama hang time.
Jumlah awal BAL berpengaruh terhadap penurunan pH setelah hang time. Untuk suhu rekonstitusi yang sama, susu dengan jumlah awal BAL 109 CFU/mL mengalami perubahan pH yang lebih signifikan dibandingkan dengan jumlah awal 108 CFU/mL dan 106 CFU/mL. Misalnya pada kompetisi dengan suhu rekonstitusi 70 oC, BAL 109 CFU/mL mampu menurunkan pH dari 6.06 ke 4.58 atau terjadi penurunan pH sebesar 1.48. Pada suhu rekonstitusi yang sama, derajat penurunan pH susu dengan jumlah awal BAL 108 CFU/mL lebih kecil, yaitu 0.36. BAL dengan jumlah awal 106 CFU/mL bahkan tidak menyebabkan penurunan pH ditunjukkan dengan kenaikan nilai pH sebesar 0.10. Dengan demikian, semakin tinggi jumlah awal BAL maka semakin tinggi pula tingkat penurunan pH setelah hang time. Fenomena ini berhubungan dengan kemampuan L. rhamnosus R21 untuk menghasilkan asam laktat dengan cara memfermentasi laktosa. L. rhamnosus R21 merupakan bakteri asam laktat homofermentatif dimana hasil fermentasi utamanya adalah asam laktat (Hartanti 2007).
Suhu rekonsitusi berpengaruh terhadap penurunan pH susu kontrol setelah hang time. Ada kecenderungan dimana suhu rekonstitusi yang semakin tinggi menyebabkan penurunan pH yang semakin rendah. Hal ini terlihat jelas pada kontrol dengan jumlah awal BAL 109 CFU/mL. Susu yang direkonstitusi pada suhu 27 oC mengalami penurunan pH sebesar 1.88, sedangkan susu yang direkonstitusi pada suhu 60 dan 70 oC masing-masing mengalami penurunan pH sebesar 0.83 dan 0.49. Namun, suhu rekonstitusi tidak tampak berperan pada penurunan pH kompetisi dengan jumlah awal BAL 109 CFU/mL dimana penurunan pH pada suhu rekonstitusi 60 oC dan 70 oC tidak jauh berbeda, yaitu masing-masing 1.30 dan 1.48. Demikian pula untuk BAL dengan jumlah awal 108 dan 106 CFU/mL, suhu rekonstitusi tidak tampak berperan pada perubahan pH setelah hang time. Baik pada suhu rekonstitusi 27, 60, maupun 70 oC, pH susu relatif tetap dari jam ke-0 hingga jam ke-8. Hal ini menandakan bahwa BAL dengan jumlah awal 108 dan 106 CFU/mL tidak menghasilkan asam laktat selama hang time.