HASIL DAN PEMBAHASAN
4. Pengaruh Lama Penyimpanan terhadap Mutu Nira Kelapa
Sampel nira kelapa disimpan untuk mengetahui pengaruh lama penyimpanan terhadap perubahan mutu nira kelapa berupa pH, jumlah bakteri asam laktat, dan bakteri pembentuk asam selama penyimpanan. Gambar 1 menunjukkan pengaruh penyimpanan terhadap rata-rata jumlah bakteri asam laktat dan bakteri pembentuk asam serta nilai pH nira kelapa Sukabumi yang disadap selama 6 jam menggunakan jerigen milik petani (pohon 1 dan 2).
Gambar 1 Pengaruh lama penyimpanan terhadap rata-rata jumlah bakteri asam laktat, bakteri pembentuk asam, dan pH nira kelapa asal Sukabumi sadapan 6 jam menggunakan jerigen petani
Penyimpanan sampel nira kelapa asal Sukabumi selama 18 jam dilakukan pada suhu rendah. Peningkatan jumlah bakteri asam laktat dan bakteri pembentuk asam terjadi selama penyimpanan pada suhu dingin tersebut. Bakteri asam laktat bersifat mesofilik. Beberapa di antaranya dapat hidup pada suhu 5oC hingga 45oC, serta dapat bertahan pada pH 3.2 hingga pH yang lebih tinggi yaitu 9.6 (Jay 2005).
0
12
Nilai pH nira yang disimpan pada suhu dingin tersebut juga mengalami penurunan hingga pH 4 akibat aktivitas mikroba yang masih berlangsung saat penyimpanan. Aktivitas mikroba tersebut memanfaatkan kandungan gula pada nira untuk melakukan fermentasi, sehingga menyebabkan penurunan nilai pH akibat asam organik yang dihasilkan dan peningkatan kadar alkohol pada nira (Battcock dan Azam-Ali 1998).
Gambar 2 menunjukkan pengaruh lama penyimpanan terhadap rata-rata jumlah bakteri asam laktat, bakteri pembentuk asam, dan nilai pH nira kelapa asal Purbalingga yang disadap selama 4 jam menggunakan plastik steril (pohon 1 dan 2). Sampel nira kelapa disimpan pada suhu ruang selama 4, 8, dan 16 jam. Rata-rata jumlah bakteri asam laktat pada sampel nira kelapa tersebut mengalami peningkatan selama penyimpanan yang juga diikuti dengan penurunan pH nira kelapa.
Gambar 2 Pengaruh lama penyimpanan terhadap rata-rata jumlah bakteri asam laktat, jumlah bakteri pembentuk asam, dan pH nira kelapa asal Purbalingga sadapan 4 jam menggunakan plastik steril
Rata-rata jumlah bakteri pembentuk asam mengalami peningkatan selama penyimpanan 4 jam, namun jumlahnya menurun pada penyimpanan 8 jam dan meningkat kembali pada penyimpanan 16 jam. Peningkatan jumlah bakteri pembentuk asam tersebut dapat disebabkan karena adanya peningkatan jumlah bakteri pembentuk asam, seperti bakteri asam asetat. Bakteri asam asetat muncul seiring dengan peranannya memanfaatkan alkohol hasil fermentasi (Kadere dan Kutima 2012). Bakteri asam asetat akan mengoksidasi alkohol menjadi asam asetat dan asam laktat menjadi CO2 dan H2O, sehingga terjadi penurunan nilai pH sampel nira (Ray 2004).
Penyimpanan selama 4 jam pada suhu ruang juga menyebabkan penurunan pH dan peningkatan rata-rata jumlah bakteri asam laktat serta bakteri pembentuk asam pada nira kelapa asal Purbalingga sadapan 6 jam menggunakan plastik steril (pohon 3 dan 4) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3.
0
13
Gambar 3 Pengaruh lama penyimpanan terhadap rata-rata jumlah bakteri asam laktat, bakteri pembentuk asam, dan pH nira kelapa asal Purbalingga sadapan 6 jam menggunakan plastik steril
Pada Gambar 4 disajikan grafik penurunan rata-rata jumlah bakteri asam laktat dan bakteri pembentuk asam, serta nilai pH nira kelapa asal Purbalingga yang disadap selama 6 jam menggunakan jerigen penampungan dan disimpan selama 4 jam pada suhu ruang (pohon 5 dan 6). Penurunan rata-rata jumlah bakteri tersebut disebabkan karena gula yang tersedia telah habis atau kadar alkohol yang dihasilkan dari fermentasi mencapai kadar limit toleransi bagi bakteri (Naknean et al. 2010).
Gambar 4 Pengaruh lama penyimpanan terhadap rata-rata jumlah bakteri asam laktat, bakteri pembentuk asam, dan pH nira kelapa asal Purbalingga sadapan 6 jam menggunakan jerigen petani
0
14
5. Isolasi dan Identifikasi Isolat dari Nira Kelapa Segar Asal Sukabumi dan Purbalingga
Identifikasi dilakukan terhadap isolat sampel dari nira kelapa segar pohon 1 dan 2 asal Sukabumi (NS1 dan NS2) dan sampel nira kelapa segar pohon 5 dan 6 asal Purbalingga (P5 dan P6). Sebanyak 10 isolat dipilih dari masing-masing cawan hasil pemupukan pada media MRSA dan GYC streptomycin. Hanya isolat dengan ciri-ciri sebagai bakteri asam laktat, yaitu Gram positif dan katalase negatif yang dipilih, sehingga terdapat 50 isolat untuk diidentifikasi.
Tabel 10 menunjukkan jumlah isolat nira kelapa segar Sukabumi dan Purbalingga yang diisolasi dari media MRSA dan GYC dengan ciri-ciri Gram positif dan katalase negatif.
Tabel 10 Jumlah isolat Gram positif dan katalase negatif pada nira kelapa segar asal Sukabumi dan Purbalingga
Asal Pohon Isolat dengan karakteristik Gram positif dan katalase negatif banyak ditemukan pada isolat yang berasal dari media GYC. Pemberian streptomycin pada awalnya digunakan untuk menekan pertumbuhan bakteri asam laktat, sehingga bakteri pembentuk asam lainnya dapat tumbuh pada media GYC (Soni 2007), namun beberapa jenis bakteri asam laktat menunjukkan ketahanan terhadap penambahan streptomycin, seperti Leuconostoc (Zdolec et al. 2011), Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei, dan Lactobacillus plantarum (Liasi et al. 2009). Isolat dengan karakteristik Gram positif dan katalase negatif tersebut diidentifikasi menggunakan beberapa uji, seperti pertumbuhan pada berbagai kondisi suhu (10, 15, 30, dan 45oC), pertumbuhan pada kadar garam 4% dan 6.5%, produksi dekstran dari sukrosa, dan produksi CO2 dari glukosa. Seluruh isolat dapat tumbuh dengan baik pada beberapa suhu yang diujikan (10, 15, dan 30oC),
15
Pada Gambar 5 disajikan hasil identifikasi berdasarkan uji produksi CO2
dari glukosa dan bentuk sel isolat. Gambar 5 menunjukkan hasil identifikasi isolat nira kelapa Sukabumi yang diisolasi dari media MRSA dan GYC. Isolat dari media MRSA didominasi oleh isolat yang bersifat heterofermentatif coccobasil dan homofermentatif coccobasil dengan proporsi yang sama. Isolat dari media GYC juga didominasi oleh isolat heterofermentatif coccobasil. Hasil identifikasi isolat dari nira kelapa segar asal Sukabumi tersebut disajikan pada Lampiran 4.
Gambar 5 Hasil identifikasi isolat nira kelapa Sukabumi dari media MRSA (a);
hasil identifikasi isolat nira kelapa Sukabumi dari media GYC (b) Gambar 6 menunjukkan bahwa isolat nira kelapa asal Purbalingga yang diisolasi dari media MRSA juga didominasi oleh isolat heterofermentatif coccobasil, sedangkan isolat yang berasal dari media GYC didominasi oleh isolat heterofermentatif basil. Hasil identifikasi isolat dari nira kelapa segar asal Purbalingga disajikan pada Lampiran 5.
Gambar 6 Hasil identifikasi isolat nira kelapa Purbalingga dari media MRSA (a);
hasil identifikasi isolat nira kelapa Purbalingga dari media GYC (b)
(a) (b)
n : 7 n : 8
n : 16 n : 19
16
Selain isolat dengan karakteristik Gram positif dan katalase negatif, ditemukan juga khamir dan isolat jenis lainnya pada hasil isolasi nira kelapa segar Sukabumi dan Purbalingga. Menurut Vidanapathirana et al. (1983), pada fase pertama fermentasi yang terjadi pada nira, ditemukan khamir dengan populasi di bawah 104 CFU/ml.Tahap identifikasi berupa uji produksi dekstran dari sukrosa dilakukan untuk mengetahui isolat dengan ciri-ciri seperti Leuconostoc mesenteroides yang membentuk koloni berlendir pada media sukrosa agar.
Leuconostoc memiliki karakteristik berupa Gram positif, katalase negatif, dan digolongkan sebagai bakteri heterofermentatif (Harrigan 1998). Berdasarkan tahap identifikasi tersebut, terdapat 26.67% isolat nira kelapa asal Sukabumi dan 57.14% asal Purbalingga yang memiliki karakteristik seperti Leuconostoc mesenteroides. Hasil identifikasi isolat dari nira kelapa segar berdasarkan produksi dekstran dari sukrosa disajikan pada Lampiran 4 dan 5.
Identifikasi lanjut dengan menggunakan API 50 CHL dilakukan pada isolat terpilih yang mewakili masing-masing kelompok hasil identifikasi. Hasil identifikasi API disajikan dalam Tabel 11. Pemilihan isolat disajikan pada Lampiran 6 dan 7. Sebanyak 17 isolat dari sampel nira asal Sukabumi dan Purbalingga dipilih untuk diidentifikasi menggunakan API 50 CHL.
Isolat nira kelapa Sukabumi didominasi oleh bakteri asam laktat jenis Weissella viridescens. Sebanyak 5 dari 9 isolat teridentifikasi sebagai Weissella viridescens (NS1 7 MC, NS1 4 GYC, NS1 2 GYC, NS2 5 GYC, dan NS1 3 GYC).
Isolat NS2 8 MC dan NS2 2 GYC diidentifikasi sebagai Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides/dextranicum 1 dan Lactococcus lactis ssp lactis.
Leuconostoc mesenteroides ditemukan sebagai mikroba awal pada nira kelapa (Cahyaningsih 2006).
Isolat NS2 3 MC dengan bentuk batang diidentifikasi sebagai Lactobacillus paracasei ssp paracasei 2. Lactobacillus paracasei ssp paracasei 2 dan Lactococcus lactis ssp lactis 1 juga ditemukan pada Mnazi produk fermentasi nira kelapa di Nigeria (Kadere dan Kutima 2012). Isolat NS1 9 GYC diidentifikasi sebagai Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii dengan kedekatan sebesar 47.20% terhadap strain tersebut. Pada awalnya isolat NS1 9 GYC memiliki kedekatan sebesar 76.10% terhadap strain Lactobacillus fructivorans, namun hasil identifikasi awal isolat tersebut menunjukkan bahwa isolat NS1 9 GYC memiliki sifat homofermentatif, sedangkan Lactobacillus fructivorans digolongkan sebagai bakteri asam laktat heterofermentatif (Fugelsang dan Edwards 2007). Hal tersebut menyebabkan isolat NS1 9 GYC diidentifikasi sebagai Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii.
Isolat P6 2 M0 dan P5 6 M0 asal Purbalingga diidentifikasi sebagai Weissella viridescens. Weissella viridescens merupakan bakteri Gram positif, katalase negatif dengan bentuk batang pendek dengan ujung membulat atau oval, dan bersifat anaerobik fakultatif, serta memfermentasi glukosa secara heterofermentatif (Lahtinen et al. 2012). Isolat lainnya diidentifikasi sebagai Lactobacillus collinoides, Lactobacillus fructivorans, dan Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 1.
17 Tabel 11 Hasil identifikasi isolat dari nira kelapa segar Sukabumi dan
Purbalingga menggunakan API 50 CHL
Jenis bakteri asam laktat yang banyak ditemukan pada sampel nira Purbalingga, yaitu Lactobacillus brevis 1 dengan persen identifikasi yang rendah.
Hasil pembacaan profil biokimia oleh software APIwebTM terhadap ketiga isolat (P6 8 G0, P6 1 G0, dan P6 7 G0) menunjukkan ketiga isolat tesebut berasal dari jenis Lactococcus lactis ssp lactis 1 dengan persen identifikasi sebesar 57.60%, namun hasil identifikasi awal menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut memiliki bentuk sel berupa batang dan tergolong dalam jenis heterofermentatif sedangkan Lactococcus lactis ssp lactis memiliki bentuk sel berupa kokus dan bersifat homofermentatif. Lactobacillus brevis 1 merupakan takson berikutnya yang muncul pada hasil identifikasi API ketiga isolat tersebut. Lactobacillus brevis sering ditemukan pada tanaman yang busuk (Kandler dan Weiss 1986; Pande et al.
2011). Pengamatan terhadap bentuk sel ketiga isolat dilakukan untuk memastikan kesesuaian hasil identifikasi. Bentuk sel ketiga isolat tersebut menunjukkan bentuk yang serupa dengan Lactobacillus brevis hasil isolasi dari jagung yang mengalami fermentasi spontan (Rahmawati et al. 2013).
Asal Kode Isolat Hasil Identifikasi API Persen Identifikasi
NS2 8 MC Leuconostoc mesenteroides ssp
mesenteroides/dextranicum 1 99.50%
NS2 2 GYC Lactococcus lactis ssp lactis 1 99.90%
NS2 3 MC Lactobacillus paracasei ssp
paracasei 2 87.30%
NS1 9 GYC Lactobacillus delbrueckii ssp
delbrueckii 47.20%
Purbalingga
P6 2 M0 Weissella viridescens 93.60%
P5 6 M0 Weissella viridescens 94.40%
P6 10 M0 Lactobacillus collinoides 67.50%
P5 8 G0 Lactobacillus fructivorans 76.10%
P6 8 M0 Lactobacillus delbrueckii ssp
lactis 1 70.70%
P6 8 G0
Lactobacillus brevis 1 3.20%
P6 1G0 P6 7 G0
18
(b) (a)
Gambar 7 Bentuk sel isolat P6 1 G0 yang berasal dari nira (a); bentuk sel isolat P6 7 G0 yang berasal dari nira (b); bentuk sel isolat P6 8 G0 yang berasal dari nira (c); bentuk sel Lactobacillus brevis dari jagung (Rahmawati et al. 2013) (d) pada perbesaran 1000x