4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3 Karakteristik Enzim Xilanase
4.3.2 Pengaruh pH
optimum. Xilanase yang merupakan enzim dan tentu saja mengikuti sifat-sifat protein pada umumnya, dimana protein mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun basa terutama pada gugus residu terminal karboksil dan terminal aminonya. Diperkirakan terjadinya perubahan keaktifan enzim xilanase akibat adanya perubahan ionisasi pada gugus ionik enzim baik pada sisi aktifnya maupun sisi lain yang secara tidak langsung mempengaruhi sisi aktif. Gugus ionik berperan dalam menjaga konformasi sisi aktif dalam mengikat substrat.
Gugus fungsionil pada sisi aktif yang dapat terionisasi memegang peranan kunci pada suatu reaksi katalisa enzim. Reaksi pengikatan dan pelepasan ion hidrogen pada gugus fungsionil tersebut, dapat dianggap sebagai reaksi antara enzim dengan suatu ligan secara umum (logam, asam atau molekul lain) (Suhartono, 1989). Ketahanan enzim terhadap pH dan keaktifan relatifnya dapat dilihat pada Gambar 17 dan 18.
40 Gambar 17. Ketahanan enzim xilanase terhadap pH
Pada grafik tersebut terlihat bahwa enzim xilanase yang diuji tahan pada kisaran pH 4 – 8, dengan aktifitas enzim tertinggi pada pH 6. Pengujian ketahanan enzim xilanase pada pH 6 menunjukkan bahwa aktifitas enzim mencapai 5,8 U/ml pada inkubasi selama 15 menit. Enzim masih dapat mempertahankan keaktifan relatifnya sebesar lebih dari 90% selama 15 menit awal kemudian menurun menjadi 44% pada menit ke-30 dan semakin menurun seiring meningkatnya waktu inkubasi hingga tersisa 13% pada menit ke-120.
Gambar 18. Persentase keaktifan relatif xilanase terhadap pH
0 1 2 3 4 5 6 7 0' 15' 30' 45' 60' 90' 120' ak ti fi ta s xilan ase (U/ml) waktu (menit) pH 4 pH 6 pH 8 pH 7.5 0 20 40 60 80 100 120 0' 15' 30' 45' 60' 90' 120' ak ti fi ta s re latif xi lan as e (% ) waktu (menit) pH 4 pH 6 pH 8 pH 7.5
41 Pada pH 4 aktifitas awal xilanase sebesar 3,3 U/ml dan keaktifan relatifnya sangat menurun sejak 15 menit awal inkubasi menjadi sebesar 0,66 U/ml atau sebesar 20% dari aktifitas awal. Pada pH 7,5 aktifitas awal xilanase adalah 1,22 U/ml. Xilanase masih dapat mempertahankan keaktifan relatif pada menit ke-45 sebesar 51% dan semakin menurun pada menit ke-120 menjadi 0,31 U/ml atau sebesar 25% dari aktifitas awal. Pada pH 8 aktifitas awal xilanase adalah 2,1 U/ml. Keaktifan xilanase menurun pada menit ke-30 yaitu menjadi 1,23 U/ml atau sebesar 58% dari aktifitas awalnya dan pada akhir pengamatan diperoleh keaktifan relatif tersisa sebesar 18%. Berdasarkan data tersebut diatas terlihat bahwa xilanase yang dihasilkan lebih stabil pada pH 7,5 dibandingkan pada pH 6 meskipun aktifitasnya jauh lebih kecil.
Menurunnya aktifitas enzim karena perubahan pH larutan disebabkan oleh berubahnya keadaan ion enzim dan seringkali juga ion substrat. Perubahan ini dapat terjadi pada residu asam amino yang berfungsi katalitik pengikat substrat maupun pada residu asam amino yang berfungsi untuk mempertahankan struktur tersier dan kuartener enzim yang aktif. Aktifitas enzim yang mengalami penurunan itu dapat dipulihkan kembali dengan merubah kondisi reaksi enzimatis pada pH optimumnya. Pada pH tertentu perubahan muatan ion pada rantai samping yang yang dapat terionisasi dari residu asam amino enzim menjadi terlalu besar sehingga mengakibatkan denaturasi enzim yang disertai dengan hilangnya aktifitas katalitik enzim. Perubahan struktur tersier dapat menyebabkan kelompok hidrofobik kontak langsung dengan air sehingga solubilitas enzim berkurang. Berkurangnya solubilitas ini mengakibatkan turunnya aktifitas enzim secara bertahap (Meryandini et al. 2008; Palmer 1981).
Protein dalam kondisi terlarut cenderung mudah berinteraksi dengan pelarutnya, sehingga bila terjadi perubahan pH larutan diatas atau dibawah pH optimumnya, maka akan langsung bersentuhan dengan sisi aktifnya. Akibatnya akan terjadi penurunan aktifitas enzim dengan cepat (Scopes 1987).
Nilai pH optimum enzim xilanase dari Bacillus sp strain K-1 adalah 5,5 dan aktifitasnya masih stabil pada pH 5,0 – 9,0. Pada pH 12 xilanase ini masih mempunyai keaktifan relatif tersisa 88% (Ratanakhanokchai et al. 1999). Xilanase yang dihasilkan oleh Bacillus stearothermophillus T-6 mempunyai
42 keaktifan tinggi pada rentang pH 5 – 11 dengan pH optimum 65 dan 7,0 dan masih mempertahankan keaktifannya sebesar 60% pada pH 10. Pada pH 9 dan suhu 65oC waktu paruh (half-life time) enzim sekitar 6 jam (Khasin et al. 1993). Xilanase dari Staphylococcus sp SG-13 mempunyai pH optimum 7,5 dan 9,2 (Gupta et al. 2000). Penelitian Wu et al . (2006) menunjukkan bahwa Geobacillus sp.MT-1 menghasilkan xilanase dengan karakteristik aktif pada rentang pH 5,5 – 10 dengan pH optimal 7 dan suhu optimumnya 70oC.
Aktifitas dan stabilitas xilanase sangat dipengaruhi selain oleh pH juga jenis bufernya. Penelitian Widhyastuti (2007) menunjukkan bahwa aktifitas xilanase dari Streptomyces sp. SKK1-8 pada pH 6,0 dalam bufer asetat lebih tinggi dibandingkan pada bufer fosfat, sedangkan pada pH 7,0 aktifitas dalam bufer fosfat dua kali lipat lebih tinggi jika dibandingkan dalam bufer tris-HCl. Data lain menunjukkan bahwa aktifitas xilanase dari Cellulomonas flavigena pada pH 6,5 dalam bufer sitrat-fosfat lebih tinggi 45% dibandingkan dalam bufer tris-HCl (Martinez-Trujilo et al. 2003). Aktifitas xilanase dari Fibrobacter succinogenes S85 dalam bufer format lebih tinggi daripada dalam bufer asetat, dan dalam bufer asetat juga lebih tinggi daripada bufer MES,MOPS dan tris-HCl (Marrone et al. 2000).
Perbedaan aktifitas dalam jenis bufer yang berbeda dikarenakan perbedaan pK bufer, jenis dan jumlah muatan ion komponen bufer. Setiap jenis bufer memiliki rentang pH tertentu dan kapasitas bufernya dipengaruhi oleh pKnya. Bufer bekerja dengan baik pada daerah pH yang dekat dengan pKnya, semakin jauh dari pK maka kapasitas bufernya semakin menurun. Muatan ion berpengaruh pada konstanta dielektrik larutan dan jumlah ion berpengaruh terhadap besarnya kekuatan ion larutan. Konstanta dielektrik dan kekuatan ion berpengaruh terhadap kecepatan reaksi enzimatis (Suhartono 1989).
4.3.3 Parameter Kinetika Reaksi Enzimatis. Pengamatan kinetika enzimatis dilakukan melalui pengukuran nilai Km dan Vmaks. Perhitungan kinetika reaksi enzimatis dilakukan dengan mengukur konsentrasi xilosa sebagai hasil hidrolisis substrat oatspelt xilan pada berbagai konsentrasi. Perhitungan nilai Km dan Vmaks dilakukan pada konsentrasi substrat dari 0,05% – 0,2%. Untuk
43 menghitung parameter Km dan Vmaks ini digunakan transformasi linier dari persamaan Michaelis-Menten, yaitu dengan membuat grafik Lineweaver-Burk dengan memetakan nilai 1/V dan 1/S. Penentuan nilai Vmaks dan Km dilakukan melalui double reciprocal dari persamaan Michaelis-Menten.
V = Vmaks S S + Km
bila diambil kebalikannya, maka rumus tersebut menjadi 1 = 1 + Km 1
S Vmaks Vmaks S
sehingga rumus diatas dapat ditulis dengan persamaan regresi Y = a + bx, dimana a = 1/Vmaks dan b = Km/Vmaks.
Data hasil hidrolisis substrat oat spelt xylan pada konsentrasi 0,5% - 2% dipetakan terhadap waktu dan dapat dilihat pada Gambar 19 sedangkan nilai Km dan Vmaks yang diperoleh disajikan pada Gambar 20.
Gambar 19. Kurva hidrolisis xilan pada berbagai konsentrasi substrat (oat spelt xylan). y = 0,310x + 1,422 R² = 0,987 y = 0,341x + 1,864 R² = 0,982 y = 0,465x + 2,345 R² = 0,987 y = 0,135x + 0,983 R² = 0,986 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 0' 5' 10' 15' 20' 25' kad ar xi losa (µmol/menit) waktu (menit) 1% 1,5% 2% 0,5%
44 Tabel 6. Nilai 1/[S] dan 1/[V] dari berbagai konsentrasi substrat
konsentrasi
substrat [S] 1/S kecepatan reaksi (V ) 1/v
0,50% 200 0,135 7,40 1% 100 0,31 3,22 1,50% 66,67 0,341 2,93
2% 50 0,465 2,15 Nilai- nilai 1/[S] yang diperoleh dari kurva hidrolisis xilan dari beberapa konsentrasi substrat dipetakan terhadap nilai-nilai 1/[V] seperti yang tertera pada Tabel 6 diatas diperoleh persamaan regresi y = 0.034x + 0.313. Berdasarkan persamaan regresi tersebut diperoleh nilai 1/Vmaks = 0.313 dan nilai Km/Vmaks = 0.034. Nilai Vmaks dari persamaan tersebut = 3,195 (µmol xilosa/menit.ml) dan nilai Km = 1,086 (mg/ml). Dapat dikatakan bahwa pada kecepatan reaksi maksimalnya xilanase dari S. aureus MBXi-K4 ini dapat menghasilkan xilosa sebesar 3,195 µmol/ menit. ml.
Gambar 20. Kurva double reciprocal Lineweaver-Burk.
Nilai Km (konstanta Michaelis-Menten) merupakan nilai konstanta yang tidak terpengaruh oleh konsentrasi enzim, sedangkan nilai Vmaks besarnya dipengaruhi oleh konsentrasi enzim. Semakin kecil nilai Km maka semakin tinggi aktifitas enzim dan afinitas enzim terhadap substrat semakin besar. Nilai Vmaks diartikan sebagai kecepatan reaksi saat enzim telah jenuh oleh substrat (Suhartono, 1989). y = 0,034x + 0,313 R² = 0,973 ‐2 0 2 4 6 8 10 12 ‐50 0 50 100 150 200 250 300 1/V 1/S