Tujuan pengembangan adalah untuk memperoleh suatu metode yang sesuai memenuhi syarat, cermat dan seksama, resolusi dan selektivitas tinggi, cepat, sensitif dan reprodisibel.
Langkah-langkah yang ditempuh adalah: 1. Pengumpulan informasi
Informasi yang penting itu mencakup jenis komponen yang akan dianalisis termasuk sifat-sifat fisikokimianya yaitu: struktur molekul, bobot molekul, keasaman dan kebasaan, spektra UV, rentang kadar, data kelarutan dan matriksnya (bentuk sediaan, pengisi dan cairan biologi, dll)
2. Pemilihan detektor
Detektor adalah suatu instrumen yang dihubungkan pada ujung akhir suatu kolom yang berfungsi memantau analit yang dipisahkan kolom.
Beberapa persyaratan yang harus dipertimbangkan dalam memilih detektor adalah : linier antara respon dengan konsentrasi, kepekaan tinggi, ketepatulangan, volume mati sel serendah ungkin dan mudah perawatannya.
Pilihan pertama detektor ditujukan pada detektor UV panjang gelombang tertentu, misalnya 254 nm. Ini dipilih karena banyak senyawa yang menyerap radiasi pada panjang gelombang ini. Jika detektor ini tidak memadai maka pilihan berikutnya pada detektor panjang gelombang beragam (multiple wavelength). Panjang gelombang pengukuran dipilih berdasarkan serapan maksimum dan absorptivitas molar (ε) analit yang akan dianalisis.
Detektor Yang Paling Sering Digunakan pada KCKT
3. Pemilihan kolom
Kolom pada HPLC merupakan faktor yang sangat menentukan karena didalam kolomlah pemisahan berlangsung. Kolom yang baik harus memberikan resolusi yang baik dengan waktu pemisahan yang tidak lama (<20 menit). Kolom HPLC berupa pipa baja tahan karat, gelas atau plastic yang berisi fase diam. Fase diam dapat berupa zat padat (pada kromatografi adsorpsi) atau berupa zat cair yang disaput pada partikel silika berpori, tetapi sekarang berupa fase terikat secara kimia pada suatu penyangga (kromatografi partisi)
4. Pemilihan fase gerak
Fase gerak memegang peranan penting dalam pemisahan analit karena migrasi analit diatur oleh interaksi fase gerak dan fase diam. Migrasi analit terjasi karena adanya kompetisi antara fase gerak dan analit untuk dapat terikat pada sisi-sisi aktif dari fase diam. Fase gerak yang dipakai biasanya merupakan campuran 2 atau lebih pelarut yang kekuatannya berbeda.
Pelarut yang kepolarannya berbeda jauh dengan kepolaran fase diam dianggap sebagai pelarut yang lemah, karena pelarut jenis ini tidak akan ditahan kuat oleh fase diam dan belum tentu dapat mengusir analit dari ikatannya dengan fase diam untuk bermigrasi. Pelarut jenis ini mempunyai kepolaran yang tidak berbeda jauh dengan fase diam.
Sifat fisika-kimia pelarut yang harus diperhatikan untuk memilih pelarut yang dipakai dalam HPLC adalah viskositas, kompresibilitas, indeks bias, tekanan uap, titik leleh, spektrum UV, nilai ambang batas, daya campur dan kepolaran.
Disamping itu pelarut yang dipakai dalam HPLC harus murni secara kimia, bebas partikel, bebas dari gas terlarut, dicampur dengan benar dan taat asas.
Kriteria pemilihan fase gerak 1. Viskositas
pelarut dengan viskosias rendah menghasilkan tekanan yang lebih rendah dibandingkan pelarut dengan viskositas tinggi pada suatu kecepatan alir tertentu. Viskositas rendah juga memungkinkan kromatografi yang lebih cepat karena perpindahan masa berlangsung lebih cepat.
2. Transparansi terhadap uv
jika detektor uv yang digunakan maka fase gerak harus transparan secara sempurna pada panjang gelombang yang digunakan. Transparansi garam-garam buffer, reagen-reagen pasangan iondan bahan tambahan lain juga harus diperhatikan.
3. Indeks bias
penting jika detektor indeks bias yang digunakan. Perbedaan indeks bias antara pelarut dengan sampel harus besar jika bekerja dengan batas-batas deteksi tertentu.
4. Titik didih
titik didih fase gerak yang rendah diperlukan jika eluat akan dilakukan pemprosesan lebih lanjut supaya memudahkan dalam penguapannya. Di satu sisi pelarut dengan tekanan uap tinggi (TD tinggi) pada suhu kamar cendrung menghasilkan gelembung-gelembung uap dalam detektor.
5. Kemurnian
tidak adanya senyawa yang mengganggu pada bentuk deteksi yang digunakan, tidak adanya senyawa yang mengganggu elusi gradien (berguna untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas), tidak adanya residu non-volatile dalam kasus pemisahan preparatif.
6.Lembam (inert) terkait dengan senyawa-senyawa sampel
fase gerak harus tidak bereaksi sama sekali dengan campuran sampel. Jika sampel yang sianalisis sangat peka terhadap oksidasi maka fase gerak dapat ditambah senyawa antioksidan.
7. Toksisitas
seorang analis harus menghindari penggunaan produk yang toksik semaksimal mungkin. Pelarut terklorinasi dapat melepaskan gas fosfen yang sangat toksik. Toluen harus menggantikan benzena yang bersifat karsinogenik, kapanpun dimungkinkan.
8. Harga
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.
Untuk fase normal, fase gerak yang sering digunakan adalah campuran pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenis alkohol.
5. Penentuan kondisi dan kesesuaian sistem
Bila memakai HPLC pada umumnya dkehendaki adanya kepastian kesesuaian dan kondisi percobaan yang dilakukan. Penentuan ini disebabkan karena adanya pengaruh kondisi yang disebabkan jenis peralatan sistem elektronik, zat uji dan kualitas pereaksi yang digunakan terhadap hasil analisis.
Kondisi percobaan yang harus ditetapkan meliputi: laju aliran pelarut, suhu kolom, kecepatan kertas perekam, attenuation dan nilai ambang yang digunakan (tinggi puncak, luas, lebar kromatogram). Untuk HPLC perlu ditetapkan juga keberulangan dari penyuntikan, waktu retensi, faktor ikutan, dll, sesuai dengan uji kesesuaian sistem yang tertera dalam Farmakope.
Kriteria penentuan kondisi percobaan dan kesesuaian sistem
Parameter Percobaan Kriteria 1.Keberulangan penyuntikan 2. Laju aliran 3. Tekanan 4. Waktu pemisahan 5. Faktor kapasitas 6. Faktor selektivitas
7. Faktor ikutan / simetris 8. Kromatogram 9. Resolusi 10. Penggunaan pelarut 11. Efisiensi kolom Koefisien variasi < 2% 1-2 mL/menit 100 – 200 bar 10 – 20 menit 1<k’<10 α>1 Tf=1
Lancip, tajam tidak melebar dan tidak berekor
R≥1,5 minimal
VARIABEL TIDAK TERKONTOL
VARIABEL TERKONTROL
Kolom
Fase Gerak Selektifitas
Kepekaan
Pemisahan Pencirian
Kromatograf
Suhu
Laju Alir
Kinerja Kolom Stabilitas Aliran Noise Drift Komposisi SAMPEL KROMATOGRAM APLIKASI : 1. Identifikasi 2.Kemurnian 3.Penetapan Kadar