BAB II TINJAUAN PUSTAKA
II.6. Pengertian RT-PCR Secara Umum
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu tekhnik yang dipakai secara
luas dalam biologi molekuler, DNA polymerase dipakai untuk memperkuat tanpa menggunakan organisme hidup (Sudjadi, 2008).
II.6.1. Sejarah RT-PCR
Dengan penemuan PCR oleh Kary Mullis, yang mendapat hadiah nobel dalam bidang kimia pada tahun 1993, setelah 7 tahun penemuan ini, untuk penemuan ini pertama kali dia mempublikasikan idenya. Ide tersebut adalah untuk mengembangkan proses multiplikasi DNA secara artifisial melalui pengulangan siklus duplikasi yang dikendalikan oleh enzim yang disebut dengan: DNA polymerase.
DNA polymerase terbentuk secara alamiah dalam organisme hidup, yang
mana fungsinya untuk duplikasi DNA ketika sel membelah. Kerja enzim ini mengikat rantai tunggal DNA dan membuat rantai komplemennya. Dalam proses PCR asli Mullis, enzim yang digunakan in vitro (dalam lingkungan luar organisme). Rantai ganda DNA dipisahkan menjadi 2 rantai tunggal dengan pemanasan 96oC. Pada temperatur ini, DNA polymerase akan rusak, sehingga enzim harus ditambahkan lagi setelah stadium pemanasan pada setiap siklus. Proses PCR asli Mullis ini sangat tidak efisien karena menghabiskan banyak waktu dan enzim DNA polymerase.
Kemudian proses PCR berkembang dengan menggunakan enzim DNA
polymerase yang diambil dari bakteri thermophilic (suka panas) yang tumbuh dalam
geiser pada temperatur di atas 110oC. DNA polymerase diambil dari bakteri ini bersifat termostabil (stabil pada suhu tinggi) sehingga ketika digunakan pada PCR,
tidak rusak waktu pemanasan untuk memisahkan rantai DNA. Sehingga tidak perlu menambahkan DNA polymerase baru untuk setiap siklus, proses PCR menjadi lebih sederhana dan efisien.
Salah satu dari DNA polymerase yang termostabil diambil dari bakteri
Thermus aquaticus dan disebut Taq. Taq polymerase di gunakan secara luas pada
praktek PCR dewasa ini. Satu kekurangan Taq adalah kadang-kadang membuat kesalahan ketika mengkopi DNA, menyebabkan terjadi mutasi (kesalahan) pada susunan DNA.
Polymerase lain, yang disebut Pwo atau Pfu, diambil dari Archaea,
mempunyai mekanisme koreksi pada kesalahan dan dapat mengurangi secara signifikan jumlah mutasi yang terjadi dalam proses mengkopi susunan DNA. Kombinasi Taq dan Pfu sekarang ini terbukti lebih teliti dan akurat dalam amplifikasi DNA (Sudjadi, 2008).
II.6.2. Penggunaan PCR
PCR digunakan untuk mengamplifati rantai pendek pada bagian tertentu dari rantai DNA. Proses PCR biasanya hanya dapat mengkopi hingga 10 Kb (kb=kilobase
pairs=1000 base pairs). Metode PCR tertentu dapat mengkopi hingga 40 Kb, yang
mana masih sangat kurang dibandingkan dengan kromosom DNA sel eukaryotic, contohnya sel manusia berisi kira-kira 3 milyar pasang basa.
Dalam prakteknya, PCR membutuhkan beberapa komponen, yaitu:
2. Two primer, merupakan bagian tertentu untuk memulai dan mengakhiri
fragmen yang akan diamplifikasi.
3. DNA polymerase, merupakan enzim yang digunakan untuk mengkopi DNA.
4. Nukleotida, di mana DNA polymerase membangun DNA baru.
5. Buffer, yang memberikan lingkungan kimia yang cocok untuk DNA polymerase.
Reaksi PCR dilaksanakan dalam thermocycler, di mana mesin PCR memanaskan dan mendinginkan tabung-tabung reaksi yang ada di dalamnya pada suhu tertentu yang dibutuhkan untuk setiap tahap reaksi (Sopian, 2006; Sudjadi, 2008).
II.6.3. Primers
Fragmen DNA yang akan diamplifikasi ditentukan oleh primers yang dipilih.
Primers adalah potongan rantai DNA artifisial, tidak lebih dari 50 nukleotid. Oleh
karena DNA biasanya mempunyai rantai ganda, panjangnya diukur dalam pasang basa. Panjang rantai tunggal DNA diukur dalam basa atau nukleotid, yang mana merupakan pasangan yang tepat dari bagian awal dan akhir fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Primers melekat pada DNA template dibagian awal dan akhir, dimana DNA polymerase mengikat dan memulai sintesis rantai DNA baru (Sudjadi, 2008). II.6.4. Prosedur
Proses PCR berisi satu seri yang terdiri dari 20-30 siklus. Setiap siklus terdiri dari 3 tahap. Pertama, rantai ganda DNA harus dipanaskan hingga 96oC untuk memisahkan rantai. Langkah ini disebut melting: di mana ikatan hydrogen yang
menghubungkan dua rantai DNA dipecahkan. Sebelum langkah pertama ini, lama pemanasan sering diperpanjang untuk memastikan bahwa template DNA dan primers telah terpisah sempurna masing-masing menjadi rantai tunggal.
Setelah rantai DNA terpisah, temperatur diturunkan sehingga primers dapat menempelkan rantainya pada rantai tunggal DNA. Langkah ini disebut annealing. Temperatur pada langkah ini tergantung pada primers dan biasanya 5oC di bawah temperatur melting. Temperatur yang salah waktu langkah annealing dapat menyebabkan primers tidak semuanya terikat pada template DNA atau terikat tidak teratur.
Akhirnya DNA polymerase harus mengisi rantai yang hilang. Ini dimulai pada
primers dan terus sepanjang rantai DNA. Langkah ini disebut elongation. Temperatur elongation tergantung DNA polymerase. Waktu untuk langkah ini tergantung pada DNA polymerase dan panjang rantai DNA yang diamplifikasi
Proses PCR terdiri dari langkah-langkah berikut: Langkah 1 : Initialization
Pemanasan campuran pada temperatur 92oC selama 3 menit untuk memastikan rantai DNA dan primers terurai. DNA polymerase dapat diberikan pada tahap ini atau ditambahkan setelahnya.
Langkah 2 : Melting
Pemanasan pada temperatur 92oC selama 30 detik. Untuk setiap siklus, waktu tersebut biasanya cukup untuk menguraikan DNA.
Langkah 3 : Annealing
Pemanasan pada temperatur 53oC selama 30 detik. Langkah 4 : Elongation
Pemanasan pada temperatur 72oC selama 1 menit. Langkah 5 : Step 2-5 diulang 40 kali.
Langkah 6 : Pertahankan campuran pada suhu 72oC selama 5 menit
Ini berguna bila PCR dimulai pada sore hari sebelum meninggalkan laboratorium, sehingga dapat berproses sepanjang malam. DNA tidak akan rusak pada temperatur 72oC setelah semalaman.
Hasil PCR dapat diidentifikasi dengan menggunakan agarose gel
electroforesis. Agarose gel electroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari
pengisian DNA dalam agarose gel dan kemudian menghubungkan arus listrik pada gel. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui gel menuju arus positif. Ukuran dari hasil PCR ditentukan dengan membandingkannya dengan suatu DNA ladder yang ukurannya sudah diketahui yang dimasukkan juga ke dalam gel (Sudjadi, 2008).
II.6.5. Reverse Transcriptase
Reverse transcriptase adalah mengubah suatu molekul RNA menjadi DNA
komplemennya. Proses ini membutuhkan suatu enzim yang disebut: reverse
transcriptase, yang diambil dari suatu retrovirus seperti: AMV (Avian Myeloblastosis Virus). Enzim yang biasanya secara bersama berhubungan dengan enzim reverse transcriptase adalah enzim RNA-dependent DNA polymerase dan enzim
DNA-dependent DNA polymerase, yang bekerja bersama membentuk transcriptase dengan
arah yang berlawanan dengan arah standar. Reverse transcriptase adalah enzim yang dihasilkan oleh semua retrovirus untuk mentranskrip informasi genetik virus dari RNA menjadi DNA, sehingga dapat berintegrasi ke dalam genom host (Sudjadi, 2008).
Dalam penelitian, reverse transcriptase menyebabkan data yang di kode pada rantai RNA dapat diubah menjadi bentuk DNA dan digunakan dalam PCR, sebab PCR tidak dapat mereplikasi molekul RNA secara langsung. Kombinasi proses
reverse transcriptase dan PCR disebut RT-PCR (Sudjadi, 2008).
