METODE Lokasi dan Waktu
3) Pengujian Ransum secara in vitro
Pengukuran Produksi Gas. Metode yang digunakan untuk mengukur produksi gas
yaitu dengan menggunakan metode uji gas Hohenheim (Hohenheim Gas Test) oleh Menkee et al. (1979) dalam Menkee dan Close (1986). Sampel ditimbang sebanyak 0,375 gram kemudian dimasukkan ke dalam syringe glass berukuran 100 ml. Kemudian disiapkan cairan rumen sebanyak 226,71 ml yang harus dijaga agar stabil pada suhu 39 ºC, kemudian ditambah dengan air destilasi hingga mencapai volume
602,84 ml. Sebelum pengambilan cairan rumen, terlebih dahulu disiapkan campuran media yang terdiri dari:
1. Larutan buffer rumen yang terdiri dari 4,0 g NH4HCO3 dan 35,0 g NaHCO3 yang ditambah 1 liter air destilasi.
2. Larutan makromineral yang terdiri dari campuran 5,7 g Na2HPO4 anhydrous, 6,2 g KHPO4 anhydrous, 0,6 g MgSO4.7H2O, dan ditambah dengan aquadest hingga mencapai volume 1000 ml.
3. Larutan mikromineral berupa campuran 13,2 g CaCl2.2H2O, 10,0 g MnCl2.4H2O, 1,0 g CoCl2.6H2O, 8,0 g FeCl2.6H2O dan ditambah air destilasi hingga mencapai volume 100 ml.
4. Larutan resazurin yang terdiri dari 0,1 g resazurine dan 100 ml air destilasi.
5. Larutan reduksi berupa campuran 3,7 ml NaOH 1 N, 580 mg Na2S.9H2O dan ditambah aquades hingga mencapai volume 60 ml. Media tersebut terdiri atas campuran 250,75 ml larutan buffer rumen, 125,38 ml larutan makromineral, 0,08 ml larutan mikromineral, 0,34 ml larutan resazurin dan 20,61 ml larutan reduksi. Kemudian campuran media tersebut yang terdiri atas buffer rumen, larutan makromineral, larutan mikromineral dan larutan resazurin dihomogenkan menggunakan magnetik stirer sambil dialiri gas CO2 selama 5 menit, kemudian ditambahkan larutan reduksi hingga warna medium berubah dari biru menjadi merah muda hingga akhirnya menjadi tidak berwarna yang menunjukkan proses reduksi yang sudah sempurna. Setelah media berwarna bening, kemudian ditambahkan cairan rumen dan diambil sisa cairan rumen ke dalam labu Erlenmeyer sebagai standar. Setelah itu, ke dalam syringe yang telah berisi sampel ransum komplit dimasukkan 30 ml campuran cairan rumen kerbau dan media, lalu dimampatkan hingga volume di dalam syringe mencapai 30 ml. Kemudian syringe tersebut diinkubasi dengan menggunakan water bath yang telah berisi air dengan suhu 39ºC. Produksi gas diamati pada 0, 3, 6, 9, 12, 24 dan 48 jam.
Rumus perhitungan produksi gas (PG) yaitu :
sampel BK x sampel g blanko PG -awal PG -akhir PG BK) mg 200 / (ml PG Keterangan :
Pengukuran Konsentrasi NH3. Sebanyak 1 ml supernatan hasil dari proses
pencernaan fermentatif disiapkan. Kemudian supernatan tersebut diletakkan di salah satu ujung alur cawan Conway (cawan Conway yang digunakan sebelumnya diolesi vaselin pada bagian bibir dan tutup). Setelah itu, tepat disebelah supernatan (masih di salah satu ujung alur cawan Conway), diletakkan K2CO3 sebanyak 1 ml dengan keadaan kedua bahan tersebut tidak bercampur sebelum cawan Conway ditutup rapat. Setelah supernatan dan larutan K2CO3 jenuh diletakkan dalam salah satu alur cawan Conway, pada cawan kecil di bagian tengah cawan Conway diletakkan larutan asam borat berindikator sebanyak 1 ml. Kemudian, cawan tersebut ditutup hingga rapat dan tidak memungkinkan ada udara yang masuk dan larutan K2CO3 dihomogenkan dengan supernatan hingga keadaan homogen dengan menggoyang -goyangkan cawan dan memiringkannya. Setelah campuran tersebut homogen, kemudian campuran tersebut didiamkan selama 2 jam pada suhu kamar. Setelah 2 jam, tutup cawan dibuka, asam borat dititrasi dengan HCl 0,01 N, sampai warnanya berubah dari biru menjadi kemerah – merahan. Besar konsentrasi NH3 dihitung dengan rumus :
Konsentrasi NH3 (mM) = volume titrasi (ml) x N HCl x Fp Keterangan : Fp = faktor pengenceran
Pengukuran Konsentrasi VFA. Sebanyak 2 ml supernatan yang juga digunakan
untuk analisis NH3 dimasukkan ke dalam tabung destilasi. Setelah itu, tabung destilasi dimasukkan ke dalam labu penyuling yang telah berisi air mendidih (dipanaskan terus selama destilasi). Uap air panas dari labu penyuling akan mendorong VFA dan kemudian dapat mengalami kondensasi dalam labu pendingin. Air yang terbentuk dari proses tersebut ditampung dalam labu Erlenmeyer sampai volume keseluruhan mencapai 100 ml. Setelah itu, ke dalam labu Erlenmeyer ditambahkan indikator phenolphthalein sebanyak 2 – 3 tetes, kemudian dititrasi menggunakan NaOH 0,01 N, sampai warna cairan dalam labu Erlenmeyer berubah dari bening tidak berwarna menjadi merah jambu. Kemudian, besar produksi VFA total dari sampel dihitung dengan menggunakan rumus dibawah ini:
VFA Total (mM) = volume titrasi (ml) x N NaOH x 10 x Fp Keterangan :
Pengukuran Degradabilitas Bahan Kering dan Degradabilitas Bahan Organik.
Fermentasi mikroba rumen dihentikan setelah 48 jam. Isi syringe dimasukkan ke dalam beaker glass dan ditambahkan larutan NDS (Neutral Detergent Solution). Selanjutnya dipanaskan hingga mendidih dan dilanjutkan reflux selama 1 jam sampai warna berubah menjadi coklat tua. Kemudian disaring dengan crucible dan diberi aseton. Setelah itu dimasukkan ke dalam oven 105 ºC untuk mendapatkan residu bahan kering (BK). Selanjutnya, residu bahan kering dimasukkan ke dalam tanur 550-600 ºC untuk mendapatkan abu. Bahan yang hilang selama dalam tanur adalah residu bahan organik (BO residu). Hal yang sama juga dilakukan pada blanko.
Degradabilitas bahan kering (DBK) dan degradabilitas bahan organik (DBO) dihitung dengan rumus sebagai berikut:
100% x (mg) sampel BK (mg)) blanko BK -(mg) residu (BK -(mg) sampel BK = (%) DBK 100% x (mg) sampel BO (mg)) blanko BO -(mg) residu (BO -(mg) sampel BO = (%) DBO
Produksi Biomassa Mikroba. Sampel residu produksi gas setelah inkubasi selama
48 jam, dipindahkan ke dalam tabung sentrifusa, kemudian disentrifusa dengan kecepatan 19.000 g (12.500 rpm), selama 20 menit. Supernatan dari hasil sentrifusa pertama diambil untuk pengukuran konsentrasi NH3 dan VFA, sedangkan residu dicuci dengan menggunakan NaCl fisiologis kemudian disentrifusa kembali dengan kecepatan 19.000 g (12.500 rpm) selama 20 menit. Proses tersebut dilakukan sebanyak 2 kali untuk membersihkan residu dari sisa media. Setelah pencucian dengan NaCl sebanyak 2 kali, kemudian dilakukan pencucian dengan aquades dan dilakukan sentrifusa dengan kecepatan 19.000 g (12.500 rpm) selama 20 menit untuk membebaskan residu dari sisa NaCl fisiologis. Residu tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cawan porselen dan dibiarkan di dalam oven 105 ºC selama 4-5 jam. Kemudian bahan yang ditimbang merupakan residu kecernaan semu ’apparent digestibility’.
Sampel residu produksi gas setelah inkubasi selama 48 jam dimasukkan ke dalam beaker glass, kemudian ditambahkan larutan NDS. Selanjutnya dipanaskan
coklat tua. Kemudian disaring dengan menggunakan crucible dengan bantuan pompa vakum dan diberi aseton. Residu yang diperoleh dimasukkan ke dalam oven 105 ºC selama 4-5 jam, dan bahan yang ditimbang merupakan residu kecernaan sebenarnya ’truly digestibility’. Produksi biomassa mikroba adalah substrat terdegradasi semu (apparent) dikurangi dengan substrat terdegradasi sebenarnya (truly) (Blummel et al., 1997 dalam Firsoni, 2005).
Produksi Biomassa Mikroba (mg) = substrat tercerna semu (apparent degraded) – substrat tercerna sebenarnya (truly degraded)