DAFTAR LAMPIRAN
II. BAHAN DAN METODE
3.3 Pengujian Sensitivitas Antibakteri Tanaman
Tahapan awal untuk mengetahui ada atau tidaknya aktivitas senyawa antibakteri dari tanaman, dilakukan uji kualitatif dengan metode kertas cakram Kirby Bauer. Hasil maserasi tanaman dengan pelarut etanol 95% dan ddH2O diujikan terhadap bakteri A. hydrophila dan S. agalactiae.
Gambar 5. Aktivitas antimikroba berbagai tanaman uji hasil ekstraksi dengan
etanol 95% pada konsentrasi 100 mg/mL terhadap bakteri A. hydrophila dan S. agalactiae.
0 5 10 15 20 25 30 A. s a ti vu m C . dome stic a C. ze doaria C . xanthorri za G . sepium P. be tle E . inulaef o lium C. alata P . spe ciosa L. l eucoc ephala T . dive rsifol ia C. e scul enta E. e latior P . sc ute llaroide s A. c o mz oides P . niruri T. c atappa A . occi dentale Chlorampenic ol K on trol pelarut ( etanol 95% ) Z o n a Ha mb at (mm) Tanaman Uji S. agalactiae A. hydrophila
14
Gambar 5 menunjukan bahwa pada konsentrasi 100 mg/mL atau 2000 µg/kertas cakram hasil ekstraksi etanol 95%, diameter hambat pada masing- masing ekstrak tanaman berbeda-beda terhadap bakteri uji. Dari 18 tanaman pada pengujian kualitatif ini, 15 tanaman (83,0%) terdapat zona hambat pada bakteri S. agalactiae dan 4 tanaman (22,2%) pada bakteri A. hydrophila. Ekstrak tanaman yang menunjukkan zona hambat baik pada A. hydrophila dan S. agalactiae adalah tanaman sirih (P. betle), kimanila (C. alata), jawer kotok (P. scutellaroides), dan jambu monyet (A. occidentale). Nilai zona hambat keempat ekstrak tanaman tersebut pada S. agalactiae lebih besar daripada A. hydrophila. Tanaman sirih (P. betle) menunjukan nilai zona hambat tertinggi dibandingkan ekstrak tanaman lainnya baik pada bakteri S. agalactiae yaitu sebesar 18,9±0,09 mm ataupun pada bakteri A. hydrophila yaitu sebesar 8,28±0,141 mm.
Gambar 6. Aktivitas antimikroba berbagai tanaman uji hasil ekstraksi dengan ddH2O pada konsentrasi 100 mg/mL terhadap bakteri A. hydrophila dan S. agalactiae.
Gambar 6 di atas memperlihatkan bahwa untuk tanaman dengan konsentrasi 100 mg/mL yang diekstrak dengan pelarut ddH2O terdapat 5 macam tanaman (27,7%) yang terdapat zona hambat pada S. agalactiae yaitu bawang putih (A. sativum), sirih (P. betle), kirinyuh (E. inulaefolium), kimanila (C. alata),
0 5 10 15 20 25 30 A . sativ um C. dom est ica C . zedoaria C. x anthorriza G. se pium P. be tle E. inul a efoli u m C . alata P. sp eci o sa L. leuc oce phala T. div ers ifolia C. esc ule n ta E. e la ti o r P . scut ell a roides A . com zoide s P . n iru ri T . catappa A . acc ide ntale Chl o rampe nicol K ontrol pelarut ( A kuabide s) Z o na ha mba t (mm ) Tanaman uji S. agalactiae A. hydrophila
15
kipahit (T. diversifolia). Tanaman sirih (P. betle) dan kimanila (C. alata), konsisten terdapat zona hambat baik pada tanaman yang diekstrak dengan etanol 95% ataupun ddH2O pada bakteri S. agalactiae. Zona hambat untuk kloramfenikol pada bakteri S. agalatiae adalah sebesar 28±0,172 mm, sedangkan zona hambat untuk bakteri A. hydrophila adalah sebesar 18,05±0,08 mm. Kontrol pelarut pada kedua jenis pelarut tersebut tidak menunjukkan zona hambat. Corner dan Beuchat (1984) dalam Elgayyar et al. (2000), memaparkan perbedaan kemampuan aktivitas penghambatan ekstrak dari tanaman terhadap bakteri uji ke dalam kategori menghambat kuat apabila zona penghambatan >11 mm, sedang (>6 - <11 mm) dan penghambatan rendah apabila kurang dari 6 mm.
Berdasarkan hasil pada Gambar 5 di atas dapat dikatakan bahwa daya hambat untuk ekstrak etanol 95% terhadap bakteri S. agalactiae, yang termasuk ke dalam kategori sedang adalah bawang putih (A. sativum) (6,6±0,05 mm), kunyit (C. domestica) (6,9±0,01 mm), petai cina (L. leucocephala) (9,8±0,05 mm), combrang (E. elatior) (6,4±0,03 mm), babandotan (A. conyzoides)
(7,7±0,04 mm), ketapang (T. catappa) (7,8±0,01 mm), jambu monyet (A. occidentale) (9,0±0,01 mm), kimanila (C. alata) (10,4±0,3 mm), sedangkan
yang termasuk ke dalam kategori kuat adalah kunyit putih (C. zedoaria) (15,4±0,09 mm), temulawak (C. xanthorriza) (13,7±0,05 mm), sirih (P. betle)
(18,9±0,09 mm), kirinyuh (E. inulaefolium) (12,4±0,1 mm), kipahit (T. diversifolia) (16,9±0,05 mm), jawer kotok (P. scutellaroides) (13,9±0,05 mm), meniran (P. niruri) (13,5±0,95 mm).
Untuk ekstrak etanol 95% terhadap bakteri A. hydrophila, sebanyak 4 macam ekstrak tanaman yang menghasilkan zona hambat termasuk ke dalam kategori sedang, yaitu sirih (P. betle) (8,28±0,141 mm), kimanila (C. alata) (6,74±0,017 mm), jawer kotok (P. scutellaroides) (6,32±0,033 mm), jambu monyet (A. occidentale) (6,72±0,021 mm). Sedangkan untuk Gambar 6 aktivitas antimikroba berbagai tanaman uji hasil ekstraksi dengan ddH2O pada konsentrasi 100 mg/mL untuk S. agalactiae semuanya termasuk ke dalam kategori sedang yaitu bawang putih (A. sativum) (6,13±0,005 mm), sirih (P. betle) (6,71±0,041 mm), kirinyuh (E. inulaefolium) (6,43±0,043 mm), kimanila (C. alata) (6,9±0,012 mm), kipahit (T. diversifolia) (6,9±0,012 mm).
16
Ekstrak etanol 95% dibandingkan dengan ddH2O berdasarkan data di atas memberikan hasil aktivitas antibakteri yang relatif tinggi, hal ini diduga karena adanya perbedaan jumlah bahan aktif pada masing-masing ekstrak. Ekstrak etanol konsentrasinya merupakan hasil dari perbandingan rendemen ekstrak kasar hasil evaporasi dengan pelarut. Sedangkan untuk ekstrak ddH2O, seperti pada umumnya konsentrasinya berasal dari perbandingan serbuk ekstrak dengan pelarut. Selain itu juga diduga karena ekstrak dari maserasi etanol memiliki lebih banyak komponen bioaktif yang terambil daripada ekstrak ddH2O.
Etanol memiliki nilai kepolaran lebih rendah dibandingkan dengan ddH2O, dalam hal ini diduga etanol lebih efektif untuk melarutkan bahan aktif pada tanaman uji. Bahan dan senyawa kimia akan mudah larut pada pelarut yang relatif sama kepolarannya. Sehingga pemilihan pelarut yang efektif akan melarutkan bahan aktif dengan hasil yang maksimal. Berdasarkan Khopkar (2003), prinsip pelarutan yang dipakai pada metode ini adalah like dissolves like artinya pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut non polar akan melarutkan senyawa non polar. Di bawah ini merupakan tabel jenis pelarut untuk ekstraksi komponen bioaktif:
Tabel 3. Jenis-jenis pelarut untuk ekstraksi komponen bioaktif.
Air Etanol Metanol Kloroform Dikloro
Metanol
Eter Aseton
Antosianin Tanin Antosianin Terpenoid Terpenoid Alkaloid Flavonol
Pati Polifenol Terpenoid Flavonoid Terpenoid
Tanin Poliasetilen Saponin Coumarin
Saponin Flavonol Tanin Asam
Terpenoid Terpenoid Xantosillin Lemak
Polipeptida Sterol Totarol
Lectin Alkaloid Quassinoid
Propolis Lakton
Flavon Phenone Polifenol Keterangan : *Sumber : Cowan (1999)
Tingkat kepolaran mempengaruhi penghambatan terhadap sel. Berdasarkan Kanazawa et al. (1995), suatu senyawa yang memiliki polaritas optimum akan mempunyai aktivitas antimikroba maksimum, karena untuk interaksi suatu senyawa antibakteri dengan bakteri diperlukan keseimbangan
17
hidrofilik-lipofilik (HLB: hydrophilic lipophilic balance). Polaritas senyawa merupakan sifat fisik senyawa antimikroba yang penting. Sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa antimikroba larut dalam fase air yang merupakan tempat hidup mikroba ; tetapi senyawa yang bekerja pada membran sel hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik sehingga senyawa antibakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik-lipofilik untuk mencapai aktivitas yang optimal.
Menurut Davidson dan Brannen (1993) dalam Fadhila (2010), semakin menurun polaritas (mendekati non-polar) akan semakin efektif menghambat bakteri Gram positif dibandingkan dengan bakteri Gram negatif. Berdasarkan Best (1999) dalam Parhusip (2006), senyawa antibakteri dapat menembus lipopolisakarida (LPS) dari dinding sel bakteri Gram negatif. Molekul-molekul yang lebih bersifat hidrofilik akan lebih mudah melewati LPS dibandingkan dengan yang hidrofobik. Di bawah ini beberapa sifat pelarut organik untuk ekstraksi :
Tabel 4. Beberapa sifat pelarut organik untuk ekstraksia.
Pelarut Polaritas (e) Konstanta
Dielektrik Titik didih (C°) Kelarutan dalam air (%) Karbondioksida 0,000 - -56,600 - Pentana 0,000 1,840 36,200 0,010 Heksanab 0,000 2,000 68,700 0,010 Toluenb 0,290 2,400 11,050 0,046 Benzenb 0,320 2,300 80,100 0,058 Etil asetat 0,380 6,000 77,100 9,800 Aseton 0,470 20,700 56,200 Larut Propan-2-ol 0,630 18,300 82,300 Larut Etanol 0,680 24,300 78,300 Larut Metanolb 0,730 32,600 64,800 Larut Air 0,900 78,500 100,000 Keterangan : a
Sumber : Houghton and Raman (1998) dalam Parhusip 2006 b
bukan pelarut bahan pangan
Bakteri Gram positif tidak memiliki lapisan LPS, sehingga fungsi penghalangnya tidak ada, akibatnya molekul senyawa antibakteri yang bersifat hidrofilik maupun hidrofobik cenderung dapat melewatinya. komponen dasar dinding sel bakteri Gram positif adalah peptidoglikan yang salah satu penyusunnya adalah asam amino D-alanin yang bersifat hidrofobik sehingga
18
kesensitifan bakteri Gram positif lebih besar terhadap senyawa antibakteri yang cenderung non-polar. Pada bakteri Gram positif, 90% dinding selnya terdiri lapisan peptidoglikan, sedangkan pada bakteri Gram negatif hanya sekitar 5-20%. Struktur dinding sel bakteri Gram negatif disajikan pada Lampiran 9, sedangkan untuk Gram positif pada Lampiran 10.
Aktivitas antibakteri dari hasil ekstraksi dengan ddH2O ataupun etanol 95% untuk bakteri S. agalactiae lebih besar dibandingkan dengan bakteri A. hydrophila hal ini diduga juga berkaitan dengan struktur sel bakteri itu sendiri. Menurut Frazier dan Westhoff (1983) dalam Fadhilla (2010), beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas antibakteri adalah: (1) jenis, jumlah, umur, (2) konsentrasi zat antibakteri, (3) suhu dan waktu kontak, (4) sifat fisik-kimia substrat, seperti: pH, kadar air, tegangan permukaan, jenis dan jumlah zat terlarut, koloid dan senyawa-senyawa lainnya. Menurut Cowan (1999), mekanisme penghambatan pertumbuhan mikroba yang disebabkan oleh bahan antimikroba adalah dengan cara bereaksi dengan dinding dan membran sel sehingga mengakibatkan gangguan pada senyawa penyusunnya, peningkatan permeabilitas membran sel yang mengakibatkan kehilangan komponen penyusun sel, inaktivasi enzim metabolik dan destruksi material genetik. Terjadinya proses tersebut karena pelekatan senyawa antimikroba pada permukaan sel atau senyawa berdifusi ke dalam sel.
Antibiotik yang dipergunakan sebagai kontrol adalah kloramfenikol 10 µg/ kertas cakram, berdasarkan hasil uji kualitatif pada bakteri A. hydrophila dan S. agalactiae masing-masing nilai zona hambatnya adalah 19,7 mm dan 27.2 mm. Prescott dan Klein (2009) dalam Fadhilla (2010), memaparkan bahwa kondisi bakteri terhadap kloramfenikol dibagi tiga yaitu yang memiliki diameter 12 mm termasuk resisten, 13-17 mm termasuk intermediet dan lebih dari 18 mm merupakan bakteri yang sensitif.
Kloramfenikol bekerja melalui penghambatan sintesis protein sehingga menghambat translasi dan traskripsi material genetik. Mekanisme penghambatan kloramfenikol dengan cara mengganggu pelekatan asam amino pada rantai peptida yang baru pada subunit 50S ribosom, dengan mengganggu daya kerja
19
peptidil transferase. Akibatnya proses perbanyakan dan pembelahan sel terganggu (Jawetz 1996).
Bakteri A. hydrophila adalah bakteri Gram negatif, panjang (1,0 – 1,5) µm, lebar (0,7 – 0,8) µm, motil, bergerak dengan sebuah flagella berbentuk batang dan motil yang tersebar di perairan tawar, bakteri ini merupakan patogen penting pada berbagai budidaya ikan yang menyebabkan kondisi fatal seperti hemorrhagic septicaemia, asymptomatic septicaemia, epizootic ulcerative syndrome, busuk ekor dan sirip serta dropsy. Bakteri ini juga dilaporkan sebagai penyebab kematian masal pada beberapa spesies budidaya, yaitu ikan mas (Cyprinus carpio L, Labeo rohita ), snakehead gurame (Channa striatus), Labeo rohita, Channa punctatus, dan ikan lele (Clarias gariepinus Bloch atau Clarias batrachus). Bakteri ini mampu memproduksi berbagai macam toksin
(Thune 1993 dalam Singh et al. 2007).
Berdasarkan karakteristik fenotip oleh Evans et al. (2002), di antaranya adalah S. agalactiae merupakan bakteri Gram positif berbentuk kokus, oksidasi negatif, katalase negatif, mampu tumbuh dalam media bile salt 40% dan NaCl 6.5 %, tidak mampu menghidrolisis esculin dan D-mannitol. Isolat S. agalactiae dari otot daging bersifat non-hemolitik terhadap media agar darah. Menurut Eldar et al. (1994), gejala klinis yang ditunjukkan oleh ikan yang terinfeksi adalah berenang lemah, cara berenang tidak normal, eksoptalmia pada mata, warna tubuh yang menghitam.
3.4 Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
Berdasarkan uji kualitatif terhadap kandungan bioaktif dari berbagai tanaman yang diekstraksi dengan etanol 95% dan ddH2O, hanya yang menunjukkan adanya zona hambat yang digunakan untuk uji lanjutan penentuan MIC. Pengujian MIC terhadap A. hydrophila dan S. agalactiae dilakukan dengan metode kontak atau macrodilution methods. Berdasarkan Pankey dan Sabath (2004), MIC dinyatakan sebagai konsentrasi terendah ekstrak tanaman uji yang dapat menghambat pertanaman mikroba sebanyak 90%-99% (1 log koloni dari jumlah koloni awal).
20
Berdasarkan cara kerjanya, antibakteri dibedakan menjadi dua, yaitu bakteriostatik dan bakterisida. Antibakteri bersifat bakteriostatik bekerja dengan cara menghambat perbanyakan populasi bakteri dan tidak mematikan sedangkan bakterisida bekerja membunuh bakteri. Bakteriostatik bisa bertindak sebagai bakterisida dalam konsentrasi tinggi (Schunak et al. 1990 dalam Parhusip 2006).
Tabel 5 merupakan hasil dari uji kontak dari berbagai macam tanaman uji yang diekstrak dengan etanol 95% tehadap bakteri S. agalactiae. Jumlah bakteri dalam CFU/mL terdapat pada Lampiran 11. Tabel 5 menunjukkan bahwa konsentrasi 0 mg/mL dinyatakan sebagai kontrol dengan jumlah koloni berkisar antara 9-9,1 log koloni/mL.
Tabel 5. Jumlah bakteri (log koloni/mL) pada MIC ekstraksi etanol 95% terhadap S. agalactiae.
No.
Jenis ekstrak
tanaman Konsentrasi tanaman uji (mg/mL)
25,000 12,500 6,250 3,130 1,562 0,781 0,390 0,195 0,095 0,000 1 A. sativum 6,3 7,0 8,5 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1 2 C. domestica 4,4 5,6 6,6 8,2 8,2 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1 3 C. zedoaria 4,9 5,05 6,1 6,6 7,1 9,3 9,0 9,0 9,0 9,0 4 C. xanthorriza 4,4 5,5 6,6 6,7 7,6 8,0 9,0 9,0 9,0 9,0 5 P. betle 4,3 5,6 5,8 6,2 7,5 9,2 9,0 9,0 9,0 9,3 6 E. inulaefolium 5,3 6,3 6,7 6,9 7,2 8,0 9,0 9,0 9,0 9,1 7 C. alata 5,9 7,1 7,3 7,6 9,2 9,2 9,0 9,0 9,0 9,0 8 L. leucocephala 6,8 6,9 7,9 8,8 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1 9 T. diversifolia 5,4 5,8 5,9 6,0 7,9 8,5 9,1 9,0 9,0 9,0 10 E. elatior 6,1 7,1 7,9 8,7 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1 11 P. scutellaroides 4,1 4,8 6,6 6,6 6,6 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 12 A. comzoides 5,5 6,7 7,7 8,7 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1 13 P. niruri 4,7 5,7 6,1 6,0 7,2 8,0 9,0 9,0 9,0 9,1 14 T. catappa 4,8 5,98 6,6 7,9 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1 15 A. occidentale 5,9 6,5 6,6 7,6 8,4 8,7 9,0 9,0 9,0 9,4
Jumlah koloni awal sebesar 6 log koloni/mL. Jumlah bakteri yang dikontakkan dengan berbagai konsentrasi ekstrak tanaman memiliki hasil yang berbeda-beda. Nilai MIC pada ekstrak etanol 95% pada S. agalactiae yang konsentrasinya 25 mg/mL terdapat 6 tanaman. Tanaman tersebut adalah kunyit (C. domestica) yang menurunkan 1,6 log koloni/mL, kunyit putih (C. zedoaria) 1,1 log koloni/mL, temulawak (C. xanthorriza) 1,6 log koloni/mL, sirih (P. betle)
21
1,7 log koloni/mL, meniran (P. niruri) 1,3 log koloni/mL, ketapang (T. catappa) 1,2 log koloni/mL. Jawer kotok (P. sctutellaroides) nilai MIC-nya berada pada konsentrasi 12,5 mg/mL yang telah menurunkan 1,2 log koloni/mL. Sedangkan 8 tanaman lainnya diduga nilai MIC-nya di atas 25 mg/mL. Tabel 6 di bawah ini merupakan hasil dari uji kontak dari berbagai macam tanaman uji yang diekstrak dengan etanol 95% tehadap bakteri A. hydrophila. Jumlah bakteri dalam CFU/mL terdapat pada Lampiran 12.
Tabel 6. Jumlah bakteri (log koloni/mL) pada MIC ekstraksi etanol 95% terhadap A. hydrophila.
No.
Jenis ekstrak tanaman
Konsentrasi tanaman uji (mg/mL)
25,000 12,500 6,250 3,130 1,562 0,781 0,390 0,195 0,095 0,000
1 P. betle 5,9 6,7 6,7 8,9 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1
2 C. alata 7,9 8,7 8,9 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1
3 P. scutellaroides 9,0 9,2 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1
4 A. occidentale 7,6 8,6 8,7 9,4 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,4
Tabel 6 menunjukkan bahwa pada ke empat tanaman uji meskipun pada konsentrasi maksimal yaitu 25 mg/mL tidak terdapat nilai MIC-nya. Sirih (P. betle) hanya menurunkan 0,1 log koloni /mL, sedangkan untuk ekstrak tanaman lainnya, jumlah bakterinya berada di atas 6 log koloni/mL yang merupakan jumlah bakteri awal. Tabel 7 merupakan hasil dari uji kontak dari berbagai macam tanaman uji yang diekstrak dengan ddH2O tehadap bakteri S. agalactiae.
Tabel 7. Jumlah bakteri (log koloni/mL) pada MIC ekstraksi ddH2O terhadap S. agalactiae.
No.
Jenis ekstrak tanaman
Konsentrasi tanaman uji (mg/mL)
25,000 12,500 6,250 3,130 1,562 0,781 0,390 0,195 0,095 0,000 1 A. sativum 6,9 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,1 2 P. betle 5,9 8,2 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,2 3 E. inulaefolium 6,6 8,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 4 C. alata 7,9 9,3 9,3 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,3 5 T. diversifolia 7,8 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,3
Berdasarkan pada Tabel 7 di atas, pada konsentrasi maksimal yaitu 25 mg/mL tidak satu pun ekstrak tanaman yang mengurangi jumlah bakteri 1 log
22
koloni dari koloni awal. Ekstrak sirih (P. betle) hanya menurunkan 0,1 log koloni/mL dari jumlah koloni awal. Jumlah bakteri dalam CFU/mL dapat dilihat pada Lampiran 13. Diagram jumlah bakteri untuk masing-masing pelarut dalam log koloni/mL terdapat pada Lampiran 14, 15 dan 16 sedangkan untuk dokumentasi uji terdapat pada Lampiran 17, 18 dan 19.
Berdasarkan data pada Tabel 5 dan 6 di atas, Gram positif lebih sensitif terhadap esktrak etanol 95% dibandingkan dengan Gram negatif. Secara umum, ekstrak etanol 95% menghambat lebih besar pada bakteri Gram positif dibanding Gram negatif. Tanaman sirih (P. betle), kimanila (C. alata), jawer kotok (P. scutellaroides), jambu monyet (A. occidentale) merupakan tanaman yang menunjukkan zona hambat pada uji kualitatif baik pada bakteri S. agalactiae ataupun A. hydrophila. Pada uji MIC ini, jumlah bakteri A. hydrophila yang dihambat cenderung lebih sedikit apabila dibandingkan dengan S. agalactiae. Menurut Parhusip (2006), nilai MIC dan minimum bactericidal concentration (MBC) senyawa antibakteri pada tanaman berbeda-beda tergantung jenis mikroba. Nilai MIC senyawa antibakteri yang lebih rendah menunjukkan bakteri lebih rentan terhadap komponen tersebut.
Cowan (1999), menyatakan adanya porin pada membran terluar pada bakteri Gram negatif membatasi difusi berbagai macam antibiotik dan berbagai macam obat terpompa kembali pada transmembran yang juga akan memompa keluar zat antimikroba melalui proses efflux aktif yang karena itu akan membuat resistensi pada Gram negatif. Menurut Pelczar dan Chan (2005), struktur dinding sel bakteri Gram positif lebih sederhana sehingga memudahkan zat antibakteri untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja, dibanding bakteri Gram negatif yang memiliki 3 lapisan.
Hasil uji kontak bakteri S. agalactiae dengan hasil ekstraksi dengan ddH2O menunjukkan bahwa jumlah bakteri yang dihambat nilainya lebih sedikit dibandingkan dengan ekstrak etanol 95%, pada jenis tanaman yang sama. Hal ini diduga karena konsentrasi bahan aktif yang terekstrak oleh ddH2O relatif sedikit apabila dibandingkan dengan etanol. Selain itu juga karena terkait dengan struktur dinding sel bakteri Gram positif yang bersifat hidrofobik sehingga zat antibakteri yang bersifat mendekati nonpolar lebih menghambat. Brannen dan Davidson
23
(1983) dalam Parhusip (2006), melaporkan bahwa secara umum penurunan polaritas dari senyawa antibakteri akan lebih efektif menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dibandingkan dengan bakteri Gram negatif.
Adanya perbedaan jumlah bahan aktif pada masing-masing ekstrak dan diduga ekstrak dari maserasi etanol 95% memiliki lebih banyak komponen bioaktif yang terambil daripada ekstrak ddH2O. Misalnya senyawa kurkumin yang terdapat pada kunyit (C. domestica). Jurenka (2009), melaporkan bahwa kurkumin merupakan lipofilik polifenol yang hampir tidak dapat larut dalam air. Cutler dan Wilson (2004), melaporkan apabila bawang putih diekstrak dengan menggunakan air maka terdapat beberapa kerugian diantaranya adalah allisin dapat bereaksi dengan air dan berubah menjadi senyawa diallyl disulphide, di mana senyawa ini tidak menunjukkan level aktivitas antibakteri yang sama dengan allisin. Menurut Ansel (1989) dalam Fadhilla (2009), dengan pertimbangan murah, mudah di dapat serta dilakukan, air dipilih dalam suatu ekstraksi sederhana. Air dalam proses ekstraksi melarutkan gom, amilum, pigmen, dan tanin. Akan tetapi sebagian besar zat dan senyawa organik dari tumbuhan tidak dapat larut dengan baik dalam pelarut polar seperti air.
Metode kontak langsung pada medium cair merupakan sebuah pengujian kuantitatif yang kemudian dilakukan platting untuk mengetahui seberapa banyak bakteri yang masih hidup. Berdasarkan data-data pada setiap ekstrak tanaman di atas, terdapat beberapa ekstrak tanaman yang apabila dalam uji kualitatif zona hambatnya termasuk ke dalam zona sedang (misal : kunyit (C. domestica), zona hambat: 6,9 mm) menunjukkan nilai MIC yang relatif sama dengan tanaman yang memiliki zona hambat tinggi (misal: sirih (P. betle), zona hambat: 18,9 mm). Hal ini diduga karena akibat adanya perbedaan laju difusi senyawa antimikroba pada medium padat dan cair. Senyawa antimikroba pada uji kualitatif kertas cakram lajunya akan terhambat oleh agar yang padat dalam medium. Berdasarkan Frazier dan Westhoff (1983) dalam Fadhilla (2010), salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas antibakteri adalah sifat fisik-kimia substrat, seperti: pH, kadar air, tegangan permukaan, jenis dan jumlah zat terlarut, koloid dan senyawa-senyawa lainnya. Menurut Radiati (2002), dalam penelitian yang telah dilakukannya menyatakan bahwa pada pengujian aktivitas antimikroba ekstrak diklorometan
24
jahe dengan difusi sumur memerlukan konsentrasi yang lebih tinggi yaitu 90 mg/mL, dibandingkan dengan pengujian metode kontak (5-20 mg/mL) terhadap bakteri Escherichia coli, Salmonella typhi, dan Vibrio cholera.
Sirih (P. betle) dari hasil uji MIC yang berasal dari ekstrak ddH2O ataupun ekstrak etanol 95%, sensitif terhadap bakteri Gram positif ataupun Gram negatif. Dibandingkan tanaman lain, sirih (P. betle) menunjukkan aktivitas antibakteri yang lebih baik. Menurut Martindale (1982) dalam Suliantari (2009), kavikol pada sirih (P. betle) mempunyai daya antimikroba lima kali lebih kuat dari fenol biasa. Tabel 8 merupakan contoh berbagai konsentrasi dari beberapa penelitian herbal yang sudah dilakukan hingga tahap in vivo dan dibandingkan dengan nilai MIC dari penelitian ini.
Tabel 8. Beberapa penelitian herbal yang telah dilakukan pada tahap in vivo.
Keterangan :
A: Aplikasi; PG: Pengobatan; PC: Pencegahan
Berdasarkan Tabel 8 yang disajikan dapat terlihat bahwa konsentrasi sirih (P. betle) dan meniran (P. niruri) pada tahap in vivo nilai konsentrasinya di bawah nilai MIC, hal ini diduga karena adanya penggabungan bahan sehingga daya antibakterinya memiliki efek sinergi, yang saling melengkapi satu sama lain. Apabila akan diaplikasikan sebagai antibakteri pada kegiatan budidaya, maka konsentrasi ekstrak sebaiknya di atas nilai konsentrasi MIC dan di bawah nilai toksisitas, agar tidak membahayakan organisme budidaya dan penggunaan bahan
Tanaman Bentuk
bahan
Konsentrasi Bakteri Sumber Nilai MIC
penelitian ini Ketapang (T. catappa) Hasil eksraksi dengan H2O PC = 60.000 mg/L PG = 120.000 mg/L A : Injeksi A. hydrophila Ashry (2007) 25.000 mg/L Meniran (P. niruri) + Bawang putih (A. sativum) Serbuk tanpa di ekstrak Meniran (P. niruri) : PG = 10.000 mg/L Bawang putih (A. sativum) PG = 40.000 mg/L A : Melalui pakan
A. hydrophila Ayuningtyas (2008) Meniran (P. niruri) : 25.000 mg/L Sirih (P. betle) + Daun Jambu biji (Psidium guajava) + Sambiloto (Andrographis paniculata) Hasil eksraksi dengan H2O Sirih (P. betle) PG = 6666,7 mg/L Daun Jambu biji (Psidium guajava) PG = 66666,7 mg/L Sambiloto (Andrographis paniculata) PG = 66666,7 mg/L A : Melalui pakan
A. hydrophila Sutama (2002) Sirih (P. betle) 25.000 mg/L
25
yang lebih efisien. Berdasarkan Anonim (2012), Kombinasi dari beberapa herbal memiliki efek sinergi yang saling melengkapi dan bahkan menambah daya khasiatnya, akan tetapi kombinasi zat aktif dalam beberapa jenis herbal juga dapat berinteraksi untuk membuat ramuan herbal menjadi lebih beracun daripada menggunakan satu jenis herbal.
Tabel 9 di bawah ini merupakan kandungan senyawa bioaktif pada tanaman yang diuji aktivitas antibakterinya. Sebagian besar tanaman memiliki komponen-komponen senyawa bioaktif yang diantaranya ada yang berfungsi sebagai zat antibakteri. Tabel 9 menunjukkan senyawa-senyawa utama dari tanaman. Sebagian besar senyawa antimikroba pada tanaman yang diuji berasal dari golongan senyawa fenolik.
Tabel 9. Kandungan bahan aktif pada tanaman yang diuji.
No. Tanaman Kandungan bahan aktif
1 Kunyit (C. domestica) Kurkuminoid, minyak atsiri (Jurenka 2009)
2 Ketapang (T. catappa) tannin, saponin, flavonoids, alkaloid, dan fenol (Ilory et al. 2007) 3 Kipahit (T. diversifolia) glycosides, tannin, flavonoid, terpenoid (Vijayan et al. 2009) 4 Babandotan (A. conyzoides)
alkaloid, coumarins, flavonoids, chromenes, benzofurans, sterol, dan terpenoid (Kamboj dan Saluja 2008)
5 Kirinyuh (E. inulaefolium)
alkaloid, flavonoid, senyawa fenolik, saponin, tannin, 4-hydroxibenzoic acid, dan glikosida (Ujowundu et al. 2011)
6 Meniran (P. niruri)
flavonoids, alkaloid, terpenoid, lignin, polifenol, tannin, kumarin, saponin (Venugopalan et al. 2011)
7 Temu lawak (C. xanthorrhiza) minyak atsiri, saponin, flavonoid, tannin (Mangunwardoyo et al. 2012) 8 Talas (C. esculenta)
sterols,flavonoids,glycosides, tannins, karbohidrateand Vitamin A and C (Desmukh et al. 2010)
9 Sirih (P. betle)
minyak atsiri dengan komponen fenolik dan kavikol (Martindale 1982 dalam Suliantari 2009)
10 Kunyit putih (C. zedoaria)
Minyak atsiri zingiberon, sineol, prokurkumenol, kurkumenol, kurkumol, epikurmenol, kurkumadiol, zederona,isofuranogermakrena (Sumarny 2006) 11 Kimanila (C. alata)
alkanoids, sequiterpen, diterpens, tripene saponin, tripene aglycouts, flavonoids, sterol, coumarin, quinines, monoterpens (Ilory 2011)
12 Jawer kotok (P. scutellaroides)
minyak atsiri, alkaloida, eugenol, etil salisilat, thymol, zat alkaloida (Asiamaya 2000 dalam Yuningsih 2007)
13 Combrang (E. elatior) Flavonoids dan senyawa fenolik(Chiang et al. 2010) 14 Jambu monyet (A. occidentale)
flavonoid dan senyawa fenolik seperti asam fenolik, stilbenes, tannin, lignin (Chermahini dan Madjid 2011)
15 Cebreng (G. sepium)
flavanoids, triterpenoid ,saponins, stigmastanol,glucoside,
rhamnogalactoside of kaempferol, coumarin, coumaric acid andmelilotic acid (Reddy dan Jose 2010)
16 Petai (P. speciosa)
Polysulfides, senyawa fenolik,terpenoid (Salman et al. 2006 dalam Al- Rokayan et al. 2012)
17 Bawang putih (A. sativum)
allisin, ajoene, dialil sulfida, dialil disulfida, yang termasuk dalam golongan senyawa tiosulfinat (Cutler dan Wilson 2004)
18 Petai cina (L. leucocephala)
tannin, terpenoid, steroid, flavonoid, saponin, mimosin, vitamin E, senyawa fenolik (Chew et al. 2011)
Berdasarkan Buck (2001), kerja dari senyawa fenol sebagai senyawa antimikroba adalah dengan membentuk ikatan pada permukaan sel kemudian berpenetrasi ke dalam sel sasaran dengan cara difusi pasif pada bakteri Gram
26
positif, sedangkan pada bakteri Gram negatif adalah dengan mengganggu ikatan hidrofobik. Kim dan Yamamoto (1996), melaporkan pada konsentrasi rendah, fenolik akan mempengaruhi membran sel sedang pada konsentrasi lebih tinggi akan dapat masuk ke dalam menyerang sitoplasma sel bakteri. Senyawa-senyawa utama antimikroba tanaman disajikan pada Tabel 10 di bawah ini.
Tabel 10. Senyawa-senyawa utama antimikroba dari tanaman (Cowan 1999).
Kelas Subkelas Contoh Mekanisme
Fenolik Terpenoid, Esensial oil Alkaloid Lectin dan polipeptida Polycatylen Fenolik sederhana Asam fenolik Quinon Flavonoid Flavon Flavonol Tanin Coumarin Catechol Epicatechin Asam cinnamic Hypericin Chrysin Abyssinone Totarol Ellagitannin Warfarin Capsaicin Berberine Piperin Mannose-spesifik agglutinin Fabatin 8S-Heptadeca-2(Z), 9(Z)- diene-4,6- diyne-1,8-diol Mengikat substrat Merusak membran sel
Mengikat adhesion kompleks pada dinding sel, inaktif enzim
Mengikat adhesion kompleks pada dinding sel