2.4. Pemberian Pakan
2.6.7 Pengukuran Kadar Protein
Metode yang dapat digunakan dalam penentuan kadar protein adalah 1. Metode Kjeldahl
Metode kjeldahl pertama kali dikembangkan pada tahun 1883 oleh Johann Kjeldahl. Metode ini didasarkan pada pengukuran kadar nitrogen total yang ada didalam sampel, karna unsur nitrogen bukan hanya berasal dari protein, maka
metode ini umumnya didasarkan pada asumsi bahwa kadar nitrogen didalam protein adalah sekitar 16%. Oleh karena itu, untuk mengubah kadar nitrogen kedalam kadar protein sering digunakan angka faktor konversi 6,25. Namun demikian, untuk beberapa jenis bahan pangan faktor konversi yang digunakan berbeda.
Tabel 5 Faktor konversi untuk mengkonversi persen nitrogen menjadi Protein
Jenis pangan x (% N dalam protein) Faktor konversi F(100/x)
Metode penetapan protein dengan metode kjeldahl dapat digunakan untuk analisis protein semua jenis bahan pangan. Prosedur penetapannya tidak membutuhkan biaya mahal dan hasilnya cukup akurat. Metode ini telah dijadikan sebagai metode resmi yang diakui oleh AOAC. Dalam penetapan protein metode kjeldahl, sampel yang akan dianalisis harus dihancurkan (destruksi) dahulu secara sempurna, sehingga seluruh karbon, hidrogen dan nitrogen diubah menjadi amonium sulfat. Proses penghancuran ini dilakukan dengan menambahkan asam sulfat ke dalam sampel dan proses pemanasan pada suhu tinggi, sehingga dihasilkan larutan berwarna jernih yang mengandung amonium sulfat. Untuk
mempercepat proses penghancuran ini, ditambahkan juga katalisator. Selanjutnya amonium sulfat dinetralkan dengan menggunakan alkali pekat dan didestilasi, destilat ditampung ke dalam beaker glass yang berisi larutan asam borat.
Kemudian dititrasi dengan asam standar. Hasil yang diperoleh merupakan kandungan protein kasar dan dalam analisis juga diperlukan larutan blanko yang digunakan sebagai faktor koreksi penentuan kadar protein.
Penentuan kjeldahl dapat dibagi menjadi 3 tahap yaitu:
a. Tahap penghancuran (destruksi)
Tahap penghancuran (destruksi) dilakukan dengan menambahkan asam kuat, yaitu asam sulfat dan dilakukan proses pemanasan pada suhu 370oC. Tahap ini akan membebaskan nitrogen dari sampel. Untuk mempercepat proses destruksi ini, juga ditambahkan potassium sulfat yang berperan untuk meningkatkan titik didih asam sulfat. Selama proses destruksi ini, nitrogen akan bereaksi dengan asam sulfat menghasilkan amonium sulfat.
b. Tahap netralisasi dan destilasi
Setelah proses destruksi selesai, larutan yang mengandung amonium sulfat ditambah dengan larutan alkali (NaOH) untuk menetralkan asam sulfat. Dengan adanya NaOH maka amonium sulfat akan dipecah menjadi gas amoniak. Melalui proses destilasi, gas amoniak ini kemudian menguap dan ditangkap oleh asam borat.
c. Tahap titrasi
Dalam tahap ini larutan asam borat dititrasi dengan menggunakan asam borat terlepas kembali dan terbentuk amonium klorida. Jumlah asam klorida yang digunakan untuk titrasi setara dengan jumlah gas NH3 yang dibebaskan dari proses destilasi. Perhitungan persen nitrogen pada sampel dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
% Protein = % N x F
Dimana F= faktor konversi dan faktor konversi tergantung dari jenis sampel
2. Metode Dumas
Metode ini diperkenalkan tahun 1831 oleh Jean-Baptiste Dumas. Metode ini telah dimodifikasi dan diotomatisasi untuk memperbaiki akurasinya. Sampel dibakar pada suhu tinggi (700-1000°C) dengan suatu aliran oksigen murni.
Seluruh karbon dalam sampel diubah menjadi karbondioksida selama pembakaran cepat. Komponen mengandung nitrogen yang dihasilkan meliputi N2 dan nitrogen oksida. Nitrogen oksida direduksi menjadi nitrogen dalam kolom copper/tembaga pereduksi pada suhu tinggi (600°C). Total nitrogen (termasuk fraksi anorganik, seperti nitrat dan nitrit) yang terlepas dibawa oleh helium murni dan dikuantifikasi dengan kromatografi gas menggunakan detektor konduktifitas termal (TCD).
Acetanilida dan EDTA berkemurnian sangat tinggi dapat digunakan sebagai standar untuk kalibrasi penganalisa nitrogen. Nitrogen yang ditentukan diubah menjadi kadar protein.
3. Metode spektroskopi Infra Merah
Spektroskopi infra merah mengukur serapan radiasi (daerah dekat atau sedang sinar infra merah) oleh molekul dalam pangan atau bahan yang lain. Gugus fungsional yang berbeda dalam menyerap frekuensi radiasi yang berbeda. Untuk protein dan peptida, berbagai pita sedang sinar infra merah (6,47 µm) dan pita sinar dekat infra merah (3300-3500 nm; 2080-2220 nm; 1560-1670 nm) karakteristik ikatan peptida dapat digunakan untuk memperkirakan kadar protein bahan pangan. Dengan radiasi sampel menggunakan panjang gelombang sinar infra merah yang spesifik untuk konstituen yang akan diukur, maka memungkinkan untuk memperkirakan konsentrasi konstituen tersebut dengan pengukuran energi yang dipantulkan atau dilewatkan oleh sampel. Spektroskopi sinar sedang infra merah digunakan dalam infrared Milk Analyzer untuk menentukan kadar protein susu, sedangkan sinar dekat infra merah dapat diterapkan pada sebagian besar olahan pangan (misalnya butiran cereal, daging dan produk susu).
4. Metode Biuret
Metode Biuret dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi protein dalam daging, sereal dan kedelai serta sebagai uji kualitatif untuk pakan ternak. Metode Biuret juga dapat digunakan untuk mengukur kadar protein dari isolate protein.
Ikatan peptida dari protein akan bereaksi dengan ion Cu 2+ membentuk kompleks berwarna ungu. Intensitas warna ungu tersebut berbanding langsung dengan konsentasi protein, dimana semakin meningkat intensitas warnanya, konsentrasi protein semakin besar. Intensitas warna ungu ini dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansi tidak tergantumg pada jenis protein, karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama persatuan berat. Hanya sedikit senyawa lain yang mengganggu reaksi, misalnya urea dan gula pereduksi yang akan bereaksi dengan ion Cu 2+.
5. Metode Lowry
Metode lowry menggabungkan reaksi biuret dengan reduksi reagen fenol Folin-Ciocalteau (asam fosfomolibdat-fosfotungstat) oleh residu tirosin dan triptofan dalam protein. Warna biru yang berkembang dibaca pada 750 nm (sensivitas tinggi untuk konsentrasi protein rendah) atau 500 nm (sensivitas rendah untuk konsentrasi protein tinggi). Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat, sehingga warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein. Metode lowry yang mudah dan sensitif menyebabkannya digunakan secara luas dalam biokimia protein, penggunaan metode lowry untuk menentukan protein dalam sistem pangan harus dilakukan ekstraksi protein terlebih dahulu dari campuran pangan.
6. Metode Pengikat Zat Warna
Metode Pengikat Zat Warna merupakan penetapan protein secara tidak langsung, zat warna mempunyai kemampuan bergabung dengan gugus polar protein yang bermuatan ion berlawanan. Kompleks tidak larut yang terbentuk kemudian dipisahkan dengan cara sentrifugasi atau penyaringan. Kemudian konsentrasi zat warna yang tidak terikat dapat diukur absorbansinya. Semakin
rendah intensitas warnanya menunjukkan semakin banyak zat warna yang diikat oleh protein yang berarti semakin tinggi kadar proteinnya. Zat warna yang dapat digunakan adalah Amido Black dan Orange G. Untuk Amido Black intensitas warna diukur pada 615 nm sedangkan untuk Orange G pada 485 nm.
7. Metode Absropsi UV 280 nm
Protein memperlihatkan absorpsi yang kuat di daerah UV dengan panjang gelombang 280 nm, terutama karena adanya residu triptofan dan tirosin dalam protein. Karena kadar triptofan dan tirosin dalam protein dari setiap sumber bahan pangan tidak konstan, maka absorbansi pada 280 nm dapat digunakan untuk memperkirakan konsentrasi protein menggunakan aturan Beer. Metode absorpsi UV 280 nm telah digunakan untuk menentukan kadar protein dalam susu dan produk daging. Namun demikian, metode ini belum banyak digunakan di dalam penentuan kadar protein sistem pangan yang lain.
8. Metode Titrasi Formol
Penetapan protein metode titrasi formol banyak digunakan untuk analisis protein pada susu. Metode ini cukup cepat dan sederhana tetapi cenderung mengukur protein lebih rendah terutama pada protein susu. Bila formaldehida ditambahkan ke dalam susu yang telah dinetralkan, formaldehida tersebut dapat bereaksi dengan gugus amino dari residu asam amino seperti lisin. Reaksi ini menyebabkan terjadinya konversi gugus –NH2 menjadi gugus N=CH 2 yang menyebabkan kehilangan sifat basa dan meningkatkan keasaman protein.
Peningkatan keasaman protein ini kemudian diukur secara titrasi dengan menggunakan sodium hidroksida dengan fenolftalein sebagai indikator. Titik akhir titrasi ditentukan berdasarkan pembentukan warna pink (Umam, 2017).
BAB 3