2.7 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi/Hplc (High Performance Liquid Chromatography)
2.7.2 Perangkat Instrumen KCKT
Perangkat dasar instrumen HPLC terdiri dari beberapa rangkaian alat anatara lain, micro prossesor, pompa yang bertekanan tinggi untuk memompakan pelarut, injektor, kolom analitik, detektor, recorder atau data prosesor yang masing-masing mempunyai fungsi berbeda. Namun bila semuanya berjalan lancar akan memberikan data yang sangat berarti dan akurat. Dengan kemurnian yang tinggi fungsi masing-masing bagian HPLC adalah sebgai berikut (willard, 1988)
Instrumen KCKT pada dasarnya tersdiri atas wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatau komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair ditunjukkan dalam gambar 5 (Rohman, 2009).
Gambar 2.2 Rangakaian Perangkat Instrumen KCKT
1. Wadah fase gerak dan fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah larut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuaran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar dari pada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik(fase diam kurang polar dari pada fase gerak), kamampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan setonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 500 psi (pound square inch) dan mampu memberikan
tekanan sampai 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusible, konstan, dan bebeas dari gangguan. Ada dua jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
3. Tempat Penyuntikan Sampel/ injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan kluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Injektor adalah alat untuk memasukkan sampel kedalam kolom yang dapat dilakukan secara otomatis ataupun manual. Bila alat HPLC dilengkapi dengan
“automotic sample injector” maka pemasukan sampel dapat dilakukan secara otomatis yaitu dengan memprogram pada “microprosesor control” jumlah sampel (µL) dan jumlah macam sampel (misalnya ada 10 macam sampel yang berbeda) yang akan dianalisa. Bisa juga dilakukan secara manual dengn cara menggunakan jarum suntik khusus, diukur volume tertentu biasanya antara 10-20 (µL) periode pekerjaan atau pergantian sampel baru. Injektor harus mampu bekerja pada tekanan 470 atm dengan keselahan (error) kurang dari 0,2% dan dapat ditempatkan dalam suatu oven agar temperatur injektor dapa terkontrol. Untuk sistem ini biasanya temperatur yang dipergunakan lebih kurang 150 oC.
4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solusi analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 µ/menit).
b) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa
c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunanakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi desebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
Panjang kebanyakan kolom antara 10-30 cm. Ukuran kolom pendek antara 3-8 cm (short, fast coloums) sedangkan panjang kolom preparatif atau kolom isolasi pada umumnya 50-100 cm. Menurut Karger (1974), Knox (1977) dan Glajch (1983) kolom dapat diklasifikasikan berdasarkan diameter, panjang dan kegunaanya menjadi:
Kolom standard
Kolom standard HPLC mempunyai diameter 4-5 mm. Ini adalah kolom siap pakai yang mempunyai keseragaman ukuran partikel adsorban dan secara
mekanik sangat stabil. Diameter partikel adsorban berkisar antara 3-5 rm, kadang-kadang lebih dari 10 fm dan ukuran yang lebih besar digunakan untuk kolom preparatif.
Kolom “Radial Compression”
Kolom ini mempunyai diameter yang lebih besar, sehingga responnya terhadap kecepatan aliran, tekana, awaktu retensi dan intensitas puncak menurun.
Penggunaan kolom ini memberikan keuntungan karena akan menurunkan sama operasional HPLCseperti tekanan dan waktu analisis (bila aliran pelarut dinaikkan).
Kolom ini terbuat dari plastik (cartridge) dengan diamter 8 mm dengan panjang 10 cm, diperlengkapi dengan pegangan (holder) plastik pemisahan akan terjadi apabila kolom mengalami tekanan dari pelarut yang dialirkan sehingga terjadi
“radial compression”, karena adanya lapisan gliserol di dalam kolom yang memberikan kelenturan pada dinding kolom. Setelah pemisahan selesai kolom kembali ke keadaan semula.
Kolom “Narrow-Bore”
Kolom ini terbuat dari bahan metal anti karat seperti halnya kolom standard, tetapi baik diameter maupun panjang kolom lebih kecil atau pendek dibandingkan kolom standard, dimana diameternya 1-2 mm dan panjangnya 5-8 cm. Penggunaan kolom ini harus diikuti dengan menggunakan pelarut yang mempunyai kualitas tinggi, karena kolom ini sangat sensitif dan akurasinya sangat tinggi. Oleh karena itu sebaiknya jumlah sampel yang diinjeksikan kurang dari 1µL. Apabila lebih dari 1µL akan memberikan tingkat gangguan (noise level) yang besar pada detektor dan tekanan sensitivias akibat kelebihan konsentrasi.
Kolom pendek (cepat)
Ukurannya yang pendek (3-6 cm) menyebabkan kolom ini disebut “short (fast) Column”. Ini sebenarnya erupakan kolom konvensional dengan diameter paritikel adsorban dan dapat mengurangi biaya pelarut. Sampel yang dilewatkan cukup besar dan memberikan sensitivitas lebih tinggi dibandingkan kolom standard. Waktu yang dibutuhkan untuk satu kali analisis berkisar antara 15-120 detik untuk sistem isokratik dan 1-4 menit untuk sistem gradien. Kolom ini sangat baik digunakan untuk pekerjaan analitik dan kontrol kualitas (QC) (Martin 1975).
Kolom pengaman dan penyaring (guard and filter)
Untuk memperpanjang masa pakai kolom HPLC biasanya pada pangkal kolom ditambahkan pelindung terhadap pengaruh fisika dan kimiawi yaitu kolom pengaman dan penyaring yang relatif pendek biasanya 5 cm dan berisikan fasa diam sejenis kolom yang akan dilindunginya. Secara periodik isinya dapat dikeluarkan dan diisi ulang kembali untuk mengeluarkan kotoran yang berasal dari sampel yang diinjeksikan
5. Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan medeteksi analtit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusible
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil
Stabil dalam pengoprasiannya
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Detektor adalah alat untuk mendeteksi komponen-komponen kimia yang telah terpisah setelah melewati kolom. Detektor yang sensitif untuk HPLC tidak bisa ditentukan. Jadi perlu dilakukan pemilihan detektor yang sesuai dengan persoalan yang dihadapi saat itu. Untuk melakukan berbagai pemisahan atau analisis mungkin diperlukan lebih dari satu detektor yang dipergunakan secara berhubungan (seri). Menurut Roston (1982), yang (1984) dan Frei (1985) detektor dikategorikan menjadi beberapa yaitu:
Detector RI (Refrsctive Inde) atau disebut juga “Differential Refractometer”
Prinsip kerja adalah memonitor perbedaan “indeks refraktif” antara fasa bergerak dan larutan yang keluar dari kolom (eluent) dan akan memberikan respon untuk setiap bahan terlarut yang mempunyai indeks refraktif yang signifikan berbeda dari fasa bergerak. Alat ini paling tidak mempunyai dua kompertemen (kuvet) yang salah satunya berisikan fasa bergerak (reffren) dan yang lainnya larutan yang keluar dari kolom, sumber cahaya (monochromatic) dan dua foto detektor.
Perbedaan indeks refraktif dari kedua kuvet inilah yang akan dirubah menjadi pulsa listrik yang akan diteruskan kerecorder untuk dirubah menjadi kromatogram.
Bulk property detector
Tipe detektor ini adalah indeks refraktif yang prinsip keseluruhan berdasarkan perbandingan pada sifat-sifat fisika dari fasa bergerak dengan atau tanpa bahan yang terlarut. Walaupun detektor ini umum dipergunakan, namum relatif kurang sensitif dan memerlukan kontrol temperatur yang baik.
Detektor UV-Vis (Ultra Violte-Visible)
Detektor ini bekerja sangat selektif untuk setiap senyawa, sehingga dalam analisis senyawa-senyawa yang mempunyai panjang gelombang berbeda sangat sulit untuk diprediksikan golongan senyawa. Detektor UV-Vis dapat dibagi atas 3 kategori yaitu;
1) Panjang gelombang tetap (fixwavelength)
2) Panjang gelombang yang bisa dirubah-rubah (variable-wavelength)
3) Panjang gelombang otomatis (scanning-wavelength)Yang dikenal dengan sebutan “diode arry detector”. Alat ini paling tidak dilengkapi dengan lampu lembayung ultra (UV).
Solutepropertydetector
Detektor ini erat hubungannya dengan sifat-sifat dari bahan-bahan cuplikan (analisis) yang tidak diperlihatkan oleh fasa bergerak. Detektor ini memiliki sensitivitas yang tinggi dan dapat memberikan sinyal untuk sampel dalam jumlah relatif kecil (nanogram). Ada beberapa macam detektor absorbansi (UV-Vis), flouresensi dan elektro-kimia (amperometric).
Detektor flourescence
Prinsip kerja dari detektor ini adalah berdasarkan perbedaan pendar (emisi) dari senyawa-senyawa yang dianalisis, sehingga detektor ini hanya dapat digunakan secara selektif untuk senyawa-senyawa yang mengeluarkan emisi sinar atau senyawa-senyawa yang dengan pemberian energi (sinar) akan tereksitasi dan mengeluarkan emisi sinar. Jadi detektor ini tidak dapat dipakai untuk semua senyawa kimia.
Detektor elektro-kimia ( amperometric)
Prinsip detektor ini didasarkan pada karakter voltameter dari molekul senyawa yang dianalisi didalam fasa bergerak air atau air-organik. Pengukuran dilakukan berdasarkan pada perbedaan potensial listrik dari molekul senyawa yang dianalisis dan fasa bergerak dibandingkan dengan potensial listrik dari fasa bergeraknya (Roston 1982)
6. Rekorder Dan Data Processing
Recorder adalah alat yang paling sederhana untuk mencatat setiap sinyal yang muncul pada detektor untuk dirubah dalam bentuk kurva atau lebih dikenal dengan kromatogram. Tinggi rendahnya kurva didasarkan pada pulsa listrik yang diterima recorder dari detektor dan tergantung pada sensitivitas detektor yang digunakan. Kadang-kadang recorder digabungkan dengan suatau sistem komputer untuk analisa data atau data prosesor dalam bentuk yang kompak dan dikenal sebagai data prosesor. Ini memudahkan bagi sepemakai untuk menganalisa data hasil pekerjaannya. Informasi yang disajikan dari hasil prosessing data antara lain, waktu retensi, peak area, persebatsi (%) dan jumlah total dari setiap kurva yang dihasilkan (Rohman, 2009).
2.7.3. Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)/ Higth Perfirmance