Penentuan V max dan K m Kolagenase M urni
11. Pereaksi untuk pengukuran aktivitas inhibitor ACE
1. Larutan HHL 50 mM
Sebanyak 0,215 g HHL dilarutkan dalam aquades hingga volume total 10 ml
2. Larutan ACE 0,8 mU
Larutan stok enzim sebanyak 5,4 U atau 5400 mU. Larutan stok ditambah 10 ml aquades sehingga didapatkan 540 mU/ml atau setiap 1 ml memiliki aktivitas 540 mU. Untuk mendapatkan aktivitas ACE 0,8 mU didapatkan 675 ml enzim ACE untuk dipergunakan dalam pengukuran aktivitas inhibitor ACE.
3. HCl 1 N
Sebanyak 20 ml HCL pekat (12 N) dilarutkan dalam aquades hingga volume total 240 ml.
4. NaCl 1 M
iii THENAWIDJAJA SUHARTONO, SUKARNO, DAHRUL SYAH and SISWA SETYAHADI.
Collagenase is endopeptidase which can cleave helical collagen into small peptide fragments.The objective of the study was to selectBacillus licheniformisF11 which produced the best collagenase, purify collagenase dan characterize the crude and purified collagenase and apply collagenase from Indonesian Bacillus licheniformis in the production of bioactive collagen peptides which act as antioxidant, inhibitor of ACE (angiotensin I-converting enzyme) and anti cancer. The Bacillus licheniformis F11.1 and F11.4 were deleted gen from B. licheniformis F11, respectively. Collagenase from B. licheniformis was selected for application to hydrolyze fish skin collagen to produce collagen peptides. B. licheniformis 11.1 produced higher protease activity as compared toB. licheniformisF11.4 when grown in LB media. The optimum production time was 15 h for B. licheniiformis F11.1 with protease activity of 0.028 U/ml or 0.909 U/mg protein.ForB. licheniformisF11.4 it was between 20-35 hours of fermentation, with enzyme activity of 0.005 U/ml or 0.157 U/mg protein. When collagen was added to the Modified LB media different responses were obtained. The activity of protease fromB. licheniformisF11.1 decreased from 0.028 U/ml or 0.909 U/mg protein to 0.005 U/ml or 0.172 U/mg protein while that of B. licheniformisF11.4 increased from 0.005 U/ml or 0.157 U/mg protein to 0.017 U/ml or 0.546 U/mg protein. Based on result from extracellular collagenase production and spesificities towards substrate and finger print substrate, B. licheniformis F11.4 was selected for further study. Enzyme purification was done with ammonium sulphate 50% (w/v) precipitation, followed by DEAE Sephadex A-50 column chromatography. Precipitation with ammonium sulphate resulted in 5-fold purification with a yield of 10.1%. After purification with DEAE Sephadex A-50 column, the enzyme was purified 26.3-fold with a yield of 2.6%. The relative molecular weight was estimated to be 124 and 26 kDa. The optimum activity of both crude and purified collagenase (without and with Ca2+) were observed at 500C. The crude enzyme had pH optimum at 9.0, while the purified enzyme at 7.0. The crude collagenase activity was inhibited by FeCl2(1mM) and CoCl2(1 mM) while CuCl2increased its activity. The purified collagenase activity was inhibited by CuCl2(1 mM), FeCl2(1 mM), MgCl2(1 mM) and CoCl2(1 mM). However, CaCl2 (10 mM), ZnCl2(5 and 10 mM) and CuCl2 (5 and 10 mM) increased its activity. The radical scavenging activity (as measured by DPPH) of the collagen peptide hydrolysed with purified collagenase was higher (30.28%) than that of these hydrolysed with crude collagenase (23.50%). However, ferric ion reduction activity of the collagen peptide hydrolysed with crude collagenase (2.12) was higher than that of the collagen peptide hydrolysed with purified collagenase (0.78) and these were also higher than the 2.0 mM BHT antioxidant used as control. The ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme) inhibitor activity of the collagen peptide hydrolysed with crude was higher (83%) as compared to that hydrolysed with purified collagenase (74%). The antiproliferation activity towards HeLa cervix cancer cells of the collagen peptide hydrolysed with purified collagenase (39.2%) was higher than that of the collagen peptide hydrolysed with crude (23.5%).The antiproliferation activity towards HCT-116 colon cancer cells of the collagen peptide hydrolysed with crude and purified collagenase were similar, with antiproliferation activity at 88.1% at concentration of 1,000 ppm.
Keywords: collagen, collagenase, Bacillus licheniformis F11.4, antioxidant, ACE inhibitor, cancer antiproliferation
iv Aplikasinya pada Pembuatan Peptida Kolagen Bioaktif. Di bawah bimbingan MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO, SUKARNO, DAHRUL SYAH dan SISWA SETYAHADI.
Kolagenase adalah endopeptidase yang dapat memecah kolagen. Kolagen dapat diperoleh dari berbagai sumber yaitu kulit dan tulang sapi, babi, ayam dan ikan.Bacillus licheniformisF11.1 dan F11.4 merupakan hasil mutasi dariBacillus licheniformis F11 asal Palembang. Tujuan penelitian ini adalah pemilahan Bacillus licheniformis F11 yang menghasilkan kolagenase tertinggi, memurnikan dan mengkarakterisasi kolagenase ekstraselular dari B. licheniformisF11 terpilih dan mengaplikasikan enzimnya dalam pembuatan peptida bioaktif. Kedua Bacillus ditumbuhkan pada media berkolagen untuk produksi kolagenase. Kolagenase dariBacillus licheniformisyang terpilih selanjutnya digunakan untuk menghidrolisis kolagen sehingga dihasilkan peptida kolagen. Peptida kolagen diuji aktivitasnya sebagai antioksidan (DPPH dan pereduksi ion ferric), inhibitor ACE (angiotensin I-converting enzyme) dan anti proliferasi sel kanker serviks (HeLa) dan sel kanker kolon (HCT-116) dengan metode MTT.
Tahap pertama penelitian bertujuan untuk memilah mutan yang menghasilkan kolagenase yang tertinggi. Hasil penelitian menunjukkan pada media Luria Bertani(LB),B. licheniformisF11.1 menghasilkan aktivitas protease yang lebih tinggi dibandingkan denganB. licheniformisF11.4. Aktivitas tertinggi B.licheniformisF11.1 adalah 0,028 U/ml atau 0,909 U/mg protein pada jam ke 15 dan B.licheniformis F11.4 adalah 0,005 U/ml atau 0,157 U/mg protein pada jam ke 5-40. Produksi pada media LB + kolagen 5% menghasilkan respon yang berbeda, aktivitas protease B. licheniformis F11.1 mengalami penurunan dari 0,028 U/ml atau 0,909 U/mg protein menjadi 0,005 U/ml atau 0,172 U/mg protein pada jam ke 20-35 sedangkan aktivitas proteaseB. licheniformisF11.4 meningkat dari 0,005 U/ml atau 0,157 U/mg protein menjadi 0,017 U/ml atau 0,456 U/mg protein pada jam ke 10-15. Hasil uji spesifitas substrat menunjukkan ketika diproduksi pada media LB, kedua protease lebih aktif pada substrat kasein dibandingkan dengan tiga protein lain (kolagen, gelatin dan fibrin). Penambahan kolagen pada media (LB + kolagen 5%) dapat menginduksi aktivitas fraksi pemecah kolagen menjadi lebih tinggi pada Bacillus licheniformis F11.4, sedangkan Bacillus licheniformis F11.1 aktivitas terhadap substrat kolagen berkurang. Hasil analisis spesifitas substrat didukung dengan hasil finger print substrate menggunakan zimogram menunjukkan pada substrat kolagen menghasilkan pita yang lebih banyak dan intensitas pita yang lebih nyata dibandingkan dengan media LB. Berdasarkan hasil dari produksi protease ekstraselularnya, spesifitas terhadap substrat dan analisis finger print berbagai substrat, B.licheniformis F11.4 dipilih sebagai isolat untuk menghasilkan kolagenase untuk penelitian tahap selanjutnya.
Tahap kedua penelitian bertujuan untuk memurnikan dan karakterisasi enzim kolagenase. Tahap pemurnian diawali dengan penambahan 50% amonium sulfat dilanjutkan dengan kromatografi DEAE Sephadex A-50. Pengendapan dengan amonium sulfat menghasilkan tingkat kemurnian sebesar 5 kali dengan
v enzim murni (tanpa dan dengan ion Ca2+) memiliki suhu optimum yang sama yaitu 500C. Pengaruh pH terhadap aktivitas kolagenase dianalisis pada kisaran pH 2,0 sampai pH 12,0 dengan menggunakan bufer universal. Enzimcrude memiliki pH optimum pada pH 9,0 dan enzim murni (tanpa dan dengan Ca2+) memiliki pH optimum pada pH 7,0. Pada pengujian pengaruh ion logam, ditemukan aktivitas kolagenase crude yang dihambat FeCl2 (1mM) and CoCl2 (1 mM) dengan persentase penurunan masing-masing sebesar 28% dan 39%, sedangkan CuCl2 meningkatkan aktivitas kolagenase crude sebesar 60%. Aktivitas kolagenase murni dihambat oleh CuCl2(1 mM), FeCl2(1 mM), CoCl2(1 mM) dan MgCl2(1 mM) dengan persentase penurunan masing-masing sebesar 44%, 60%, 94% dan 86% sedangkan CaCl2(10 mM) meningkatkan aktivitas sebesar 109%, ZnCl2 (5 mM) meningkatkan aktivitas sebesar 66% dan ZnCl2 (10 mM) meningkatkan aktivitas sebesar 72%. Ion logam CuCl2 (5 mM) dapat meningkatkan aktivitas sebesar 30% dan CuCl2 (10 mM) meningkatkan aktivitas kolagenase murni sebesar 55%.
Tahap ketiga penelitian bertujuan untuk membuat peptida kolagen dengan menggunakan kolagenase. Hidrolisis kolagen dengan menggunakan kolagenase crudemenunjukkan derajat hidrolisis tertinggi 79,41%. Hidrolisis kolagen dengan menggunakan kolagenase murni memiliki derajat hidrolisis tertinggi sebesar 52,94%. Hasil aktivitas scavenging radikal DPPH peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (30,28%) lebih tinggi dibandingkan dengan peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase crude(23,5%). Aktivitas pereduksi ionferric oleh peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenasecrude(2,12) memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan peptida yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (0,78). Aktivitas penghambatan ACE peptida kolagen yang dibuat menggunakan kolagenase crude (83%) lebih tinggi dibandingkan dengan peptida yang dibuat menggunakan kolagenase murni (74%). Hasil pengujian dengan metode MTT terhadap kemampuan proliferasi sel VERO menunjukkan peptida kolagen pada konsentrasi 100, 500 dan 1000 ppm tidak bersifat toksik terhadap sel VERO. Aktivitas penghambatan terhadap sel kanker serviks HeLa oleh peptida kolagen yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenase murni (39,2%) sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan peptida yang dihasikan dari hidrolisis kolagenase crude (33,3%). Penghambatan proliferasi sel kanker kolon HCT-116 oleh peptida yang dihasilkan dari hidrolisis kolagenasecrude dan murni pada konsentrasi 1000 ppm memiliki penghambatan proliferasi tertinggi dengan aktivitas penghambatan yang sama yaitu sebesar 88,1%.
Kata kunci: kolagen, kolagenase, Bacillus licheniformis F11.4, antioksidan, inhibitor ACE, antiproliferasi sel kanker
Latar Belakang
Protein berperan signifikan pada peningkatan kesehatan manusia selain nilai gizinya. Hidrolisis enzimatik secara luas digunakan untuk meningkatkan nilai gizi dan sifat fungsional dari protein pangan. Hidrolisat protein ikan telah dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan, antihipertensi, antiproliferasi sel kanker, antimikroba dan imunomodulator. Hidrolisat protein dengan bahan baku ikan yang menunjukkan aktivitas antioksidan yang telah dilaporkan adalah dari daging ikan Yellowfin, Alaska Pollack, Round Scaddan Pasifik Hake. Hidrolisat protein yang memiliki aktivitas sebagai inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme), diantaranya adalah hidrolisat dari ikan Sardin. Aktivitas antiproliferasi dari hidrolisat protein juga telah diteliti yaitu hidrolisat protein ikan terhadap sel kanker payudara.
Kolagen merupakan protein struktural yang berlimpah dan seluruhnya berada pada tubuh mahluk hidup. Bentuk utama dari kolagen yang dikenal sebagai kolagen tipe 1 terdapat secara luas pada kulit, otot, tulang dan organ dalam vertebrata tingkat tinggi. Vertebrata tingkat rendah seperti ikan juga memiliki kolagen tipe 1.
Peptida kolagen diperoleh melalui proses enzimatis menggunakan kolagenase dan enzim proteolitik lainnya. Penggunaan kolagenase pada pembuatan peptida kolagen lebih efektif karena kolagenase merupakan endopeptidase yang dapat memecah domaintriple helixdari kolagen. Kolagenase lebih efektif bekerja pada kolagen yang belum terdenaturasi.
Proses hidrolisis kolagen membutuhkan sumber enzim kolagenase. Pencarian sumber kolagenase sudah banyak dilakukan peneliti. Sumber kolagenase yang telah dilaporkan adalah Bacillus subtillis FS-2 (Nagano & To 1999),Bacillus subtilisCN2 (Tran & Nagano 2002),Bacillussp. MO-1 (Okamoto et al. 2001), Bacillus subtilis AS1.398 (Riu et al. 2009),Bacillus pumilus CoI-J (Wu et al. 2010), Streptomyces sp. strain 3B (Petrova et al. 2006a) dan
Streptomyces parvulus (Sakurai et al. 2009). Beberapa peneliti menggunakan organ dalam ikan sebagai sumber kolagenase yaitu organ dalam ikan makarel (Park et al. 2002), organ dalam ikan filefish (Kim et al. 2002), hepatopancreas udang (Aoki et al. 2003) dan hepatopancreas kepiting raja (Rudenskaya et al. 2004).
Berbagai pertimbangan penggunaan mikroba sebagai sumber enzim antara lain mikroba dapat tumbuh relatif cepat, ramah lingkungan, mudah diisolasi dan terbuka peluang untuk meningkatkan mutu enzim melalui rekayasa genetika. Bakteri yang berpotensi sebagai sumber kolagenase adalahBacillus licheniformis F11.1 danBacillus licheniformisF11.4. Kedua bakteri ini merupakan derivat dari B. licheniformis F11 yang diisolasi dari limbah udang di daerah Palembang Sumatera Selatan. Isolasi B.licheniformis F11 dilakukan atas kerjasama antara Laboratorium Bioindustri, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) dengan Universitas Hamburg, Jerman dalam skema Indonesia-Germany Biotechnology(IG-Biotech)phase3.
Sumber kolagen yang digunakan adalah kulit ikan bandeng yang merupakan salah satu limbah pengolahan hasil perikanan. Produksi ikan nasional tahun 2009 sekitar 10.065.120 ton (BPS 2010) tentunya menghasilkan limbah yang cukup besar. Salah satu bentuk pemanfaatan limbah kulit ikan adalah dengan dibuat menjadi peptida kolagen menggunakan kolagenase Bacillus licheniformis F11. Peptida kolagen dari kulit ikan selanjutnya diuji bioaktivitasnya yang meliputi aktivitas antioksidan, inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme) dan antiproliferasi sel kanker.
Perumusan Masalah
Kolagenase merupakan endopeptidase yang dapat memecah domaintriple helix dari kolagen. Kolagenase mempunyai banyak manfaat dan diaplikasikan pada industri pangan, farmasi dan riset, salah satunya digunakan dalam hidrolisis protein menjadi peptida bioaktif. Protein akan menghasilkan asam-asam amino
bila dihidrolisis sempurna, tetapi hidrolisis secara parsial menghasilkan molekul- molekul peptida dengan sekuen asam amino spesifik yang memiliki bioaktivitas.
Hidrolisis protein menghasilkan peptida dapat dilakukan secara parsial menggunakan asam atau basa. Mengingat proses penambahan asam maupun basa pada proses hidrolisis dapat merusak beberapa gugus asam amino dan menghasilkan senyawa karsinogenik, maka fungsi asam atau basa dapat digantikan oleh enzim yang bekerja secara spesifik. Aplikasi kolagenase perlu dilakukan dalam rangka mencari proses yang lebih efektif dan lebih ramah lingkungan.
BakteriBacillusmerupakan bakteri utama penghasil enzim secara industri. Bacillus penghasil kolagenase adalah Bacillus subtillis FS-2 (Nagano & To 1999),Bacillus subtilisCN2 (Tran & Nagano 2002),Bacillussp. MO-1 (Okamoto et al. 2001), Bacillus subtilis AS1.398 (Riu et al. 2009),Bacillus pumilus CoI-J (Wu et al. 2010), Streptomyces sp. strain 3B (Petrova et al. 2006a) dan Streptomyces parvulus(Sakuraiet al.2009). BakteriB. licheniformisF11.1 danB. licheniformis F11.4 diketahui menghasilkan protease yang tinggi, kedua bakteri ini merupakan hasil mutasi dari B. licheniformis F11 yang secara alamiah tidak memiliki chiA(chiA) dengan menghilangkan operon pembentukan poliglutamat (pga) menghasilkan B. licheniformis F11.1 (chiA, pga) dan mutasi dengan menghilangkan operon pembentukan poliglutamat (pga) dan chiBA (double mutant) menghasilkan B. licheniformis F11.4 (pga, chiBA) yang ditemukan kehilangan kitinase tetapi menghasilkan aktivitas protease yang tinggi. Diperkirakan bakeri proteolitik ini mampu memecah kolagen sebagai substrat. Pada aplikasi kolagenase dibutuhkan informasi karakteristik enzim dan kondisi kerja yang optimum. Pada beberapa aplikasi, ekstrak kasar dapat bekerja secara efisien, tetapi pada aplikasi yang lain, kolagenase yang lebih murni dibutuhkan. Untuk itu pemurnian dan karakterisasi kolagenase perlu dilakukan sebelum diaplikasikan dalam substrat kolagen. Peptida kolagen yang memiliki aktivitas bioaktif sudah banyak diteliti diantaranya peptida kolagen dari babi yang memiliki aktivitas antioksidan (Li et al. 2007), peptida kolagen dari kulit ayam yang memiliki aktivitas inhibitor ACE (Saiga et al. 2008), peptida kolagen dari kulit tuna bluefin yang memilki aktivitas anti kanker (Han et al. 2011) dan peptida
kolagen dari kulit salmon yang dapat menurunkan trigliserida pada tikus percobaan (Saito et al. 2009). Peptida kolagen yang dihasilkan oleh aktivitas kolagenase B.licheniformisF11.1 dan B.licheniformisF11.4 diharapkan memiliki aktivitas bioaktif sebagai antioksidan, inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme) dan antiproliferasi sel kanker.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah 1) memilah isolat yang menghasilkan kolagenase yang efektif dalam menghidrolisis kolagen, 2) memurnikan dan mengkarakterisasi kolagenase ekstraseluler dari B. licheniformisF11 terpilih dan 3) mengaplikasikan enzimnya dalam pembuatan peptida kolagen dari kulit ikan bandeng serta melakukan pengujian sifat bioaktif peptida kolagen yang dihasilkan yaitu aktivitas antioksidan, inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme) dan antiproliferasi sel kanker (sel kanker serviks HeLa dan sel kanker kolon HCT- 116).
Hipotesis
Hipotesis dalam penelitian ini adalah kolagenase dari bakteri Bacillus licheniformis F11 asal Palembang dapat digunakan untuk memproduksi peptida kolagen. Peptida kolagen hasil hidrolisis kolagenase Bacillus licheniformis F11 bersifat antioksidan, inhibitor ACE (Angiotensin I-Converting Enzyme) dan antiproliferasi sel kanker.
Kolagenase
Kolagenase merupakan endopeptidase yang dapat memecah domaintriple helix dari kolagen. Berdasarkan fungsi fisiologisnya, kolagenase digolongkan menjadi dua tipe, yaitu serin kolagenase dan metallokolagenase. Serin kolagenase seperti semua serin proteinase, memiliki residu serin pada sisi katalitiknya (Daboor et al. 2010). Serin kolagenase memiliki berat molekul pada kisaran 24 - 36 kDa (Roy et al. 1996 dalamDabooret al. 2010), enzim ini berhubungan dengan organ pencernaan (Zefirovaet al. 1996) dan dapat memecah strukturtriple helix kolagen tipe I, II dan III serta terlibat pada produksi hormon dan degradasi protein, pembekuan darah dan fibrinolisis (Neurath 1984). Metallokolagenase merupakan enzim yang mengandung Zn yang membutuhkan kalsium untuk kestabilan (Stricklin et al. 1977). Metallokolagenase merupakan anggota Matrix Metalloproteinase (MMP) dengan berat molekul yang bervariasi dari 30 hingga 150 kDa (Harris & Vatar 1982). Selain itu, metallokolagenase termasuk dalam enzim ekstraseluler yang terlibat dalam pembentukan kembali matriks ekstraseluler, jenis enzim ini telah banyak dipelajari dari berbagai jaringan mamalia, bakteri dan bisa ular (Parket al.2002).
Kolagenase mempunyai banyak manfaat dan diaplikasikan pada industri pangan, obat-obatan dan riset, salah satunya digunakan dalam hidrolisis protein. Semua protein akan menghasilkan asam-asam amino bila dihidrolisis, tetapi ada beberapa protein yang disamping menghasilkan asam amino juga menghasilkan peptida (Bjarnason 2001). Gesualdo & Li-Chan (1999) menyatakan bahwa hidrolisis protein untuk menghasilkan peptida dan asam amino dapat dilakukan secara parsial menggunakan asam atau basa. Hidrolisis menggunakan asam maupun basa dapat merusak beberapa gugus asam amino dan menghasilkan senyawa karsinogenik, maka fungsi asam atau basa dapat digantikan oleh enzim yang spesifik. Pencarian enzim penghidrolisis kolagen (kolagenase) perlu dilakukan dalam rangka mengganti penggunaan asam dan basa.
Salah satu sumber enzim kolagenase yang telah diketahui adalah dari bakteri. Penelitian ekstraksi kolagenase dari bakteri sudah banyak dipublikasikan. Beberapa bakteri yang menghasilkan kolagenase adalah Bacillus subtillis FS-2 (Nagano & To 1999), Bacillus subtilis CN2 (Tran & Nagano 2002), Bacillus sp. MO-1 (Okamotoet al.2001),Bacillus subtilisAS1.398 (Riuet al.2009),Bacillus pumilusCoI-J (Wuet al.2010), Streptomycessp. strain 3B (Petrovaet al.2006a) dan Streptomyces parvulus (Sakurai et al. 2009). Beberapa karakterisasi kolagenase dari bakteri hasil penelitian sebelumnya terdapat pada Tabel 1.
Konformasitriple-helixmembuat kolagen resisten terhadap sebagian besar proteinase. Pada vertebrata, enzim yang dapat memecah triple-helix kolagen adalah kolagenase (Visse & Nagase 2003) dan kathepsin K (Garneroet al. 1998). Kathepsin K memecah kolagen pada lingkungan asam, sedangkan enzim kolagenolitik bekerja pada lingkungan pH netral dan termasuk anggota dari matriks metalloproteinase (MMP) (Sternlicht & Werb 2001). Grup yang termasuk kolagenase adalah MMP-1, MMP-8, MMP-13 dan MMP-18 dan yang termasuk gelatinase A adalah MMP-2 (Aimes & Quigley 1995; Pattersonet al. 2001).
Chung et al. (2004) menyelidiki mekanisme kolagenase dalam mendegradasi jaringan kolagen. Pada penelitiannya secara in vitro, digunakan dua substrat, yaitu kolagen utuh tipe I (kolagen fibril dari kulit dan tulang hewan) dan gelatin. Kolagenase yang digunakan adalah prototipe MMP-1 (E200A). Pada perbedaan substrat ini kolagenase mempunyai aktifitas yang tinggi pada kolagen dibandingkan dengan gelatin, sehingga ini membuktikan bahwa kolagenase lebih efektif bekerja pada kolagen yang belum terdenaturasi. Kolagenase dapat memecah tripolipeptida walaupun pada suhu tubuh 37 oC bahkan 100C dan 40C walaupun lebih sedikit kolagen yang terpecah.
Kolagenase disintesis sebagai pre-proenzim dan disekresikan sebagai proenzim yang inaktif yang mengandung propeptida, domain katalitik, bagian yang kaya akan prolin dan domain C-terminal hemopexin (Hpx). Clark & Cawston (1989) pertama kali melaporkan pemecahan triple-helix kolagen oleh MMP-1 (kolagenase 1) yang membutuhkan domain C-terminal Hpx (hemopexin). Domain katalitik dalam keadaan sendiri masih memiliki aktivitas proteolitik pada
peptida dan protein non kolagen tetapi tidak dapat memecah kolagen (Clark & Cawston, 1989).
Tabel 1. Karakteristik kolagenase dari beberapa bakteri
Sumber Berat Molekul (kDa) pH optimum Suhu Optimum (0C) Ion logam sebagai aktivator Ion logam sebagai inhibitor Literatur Bacillus licheniformis N22 120 dan 29 Asdornnit- heeet al. (1994) Bacillus subtilis CN2 14-30 Tran & Nagano (2004) Bacillus cereus MBL13 38 7–8,5 50 Ca2+, Zn2+dan Mg2+ Cu2+ Liuet al. (2010) Bacillus subtilis FS-2 125 9 50 Hiroko & Kim (1999) Bacillussp. MO-1 210 dan 105 9 70-75 Okamoto et al. (2001) Bacillus pumilusCOI-J 58,64 7,5 45 Ca2+ dan Mg2+ Mn2+dan Pb2+ Wuet al. (2010) Alicyclobacillus sendaiensis Strain NTAP-1 37 3,9 60 Tsuruoka et al. (2003) Pseudomonas sp 45 7,4 45 Hisano et al (1989) Streptomyces parvulus 52 9 37 Sakuraiet al. (2009) Streptomyces sp. strain 3B 116 dan 97 7,5 37 Petrovaet al. (2006a) Streptomyces exfoliausCFS 1068 14,5 7 70 Jain & Jain (2010) Thermoactinom ycessp. 21E 50 9-9,5 70-75 Petrovaet al. (2006b) Streptomyces sp. A8 75 Ca2+dan Mg2+ Pb2+, Ag2+, Cu2+dan Zn2+ Chakrabor- ty & Chandra (1986)
Menurut Chunget al. (2004) domain katalitik yang mengandung Zn pada sisi aktifnya berikatan dengan substrat kolagen. Kemudian kolagenase pada bagian domain ini akan menggerakkan substrat kolagen triple helix yang kaku. Akibatnya ikatan antar residu asam amino Gly775-Ile776 pada α1(I) dan Gly775- Leu776pada α2(I) terhidrolisa dan terputus, sehingga rantai terpecah manjadi dua fragmen, ¼ dan ¾ fragmen, dimana N terminal berada pada fragmen ¼. Ikatan yang terputus pertama kali adalah pada salah satu rantai α1(I). Gambar langkah- langkah pemecahan kolagen oleh kolagenase tersaji pada Gambar 1.
Gambar 1. Langkah-langkah pemecahan kolagen oleh kolagenase. Kolagenase mengikat pada kolagen sebelum memecah triple-helix kolagen (Chunget al.2004).
Sebagai enzim proteolitik, kolagenase banyak diaplikasikan pada bidang industri. Kolagen merupakan bagian yang menyebabkan daging merah menjadi liat, enzim kolagenase digunakan untuk mengempukkan daging (Cronlund & Woychik 1987). Kolagenase banyak digunakan pada proses penyamakan kulit
(Kanth et al. 2008). Aplikasi kolagenase lainnya adalah pada pembuatan peptida kolagen.
Peranan kolagenase sangat penting dalam bidang biomedis. Rilley & Herman (2005) meneliti kolagenase untuk proses penyembuhan luka secara in vitrodan in vivo. Secarain vitroyaitu dengan menggunakan matriks ekstraseluler yang diberi perlakuan menggunakan kolagenase Clostridial (protease nonspesifik) dan bufer sebagai kontrol. Keratinosit disebar (plated) di atas matriks tersebut dan diamati parameternya yaitu ada dan tidak adanya kolagenase,heparin binding epidermal-like growth factor, proliferasi dan migrasi sel. Keratinosit merupakan membran dasar yang menyediakanscaffoddan matriks signal makromolekul yang bertanggung jawab terhadap regulasi sel selama masa perkembangan, dewasa, dan penyembuhan luka. Secara in vivo, digunakan luka pada bagian tubuh belakang Yucatan micropigs dengan membandingkan pengaruh kolagenase tersebut dengan Regranex (PDGF-BB) dan Solosite (carboxymethyl cellulose). Hasil dari penelitian Rilley & Herman (2005) menyimpulkan bahwa pada semua parameter yang diteliti yaitu pembentukan jaringan granulasi, inflamasi, re-epitelisasi, dan lama waktu penyembuhan menunjukkan bahwa dengan adanya kolagenase, parameter yang diteliti lebih baik dibandingkan perlakuan yang lain. Sehingga dapat disimpulkan bahwa kolagenase dapat menstimulasi respon seluler keratinosit pada luka secarain vitrodan dapat merupakan pendekatan terapi untuk penyembuhan luka secara in vivo. Penggunaan kolagenase lainnya yang cukup penting dalam bidang biomedis adalah dalam perbaikan radang pada jaringan, transplantasi klinis, fungsi seluler dalam penggumpalan darah, fibrinolisis dan fertilisasi (Simpson 2000).
Kolagen
Kolagen adalah salah satu protein utama dalam mahluk hidup. Kolagen terdiri dari tiga rantai polipeptida yang besar dan berulang. Polipeptida tersebut adalah glisin-prolin dan hidroksiprolin. Kolagen mengandung kira-kira 35% glisin dan 11% alanin, persentase asam amino ini agak luar biasa tinggi. Kandungan asam amino lainnya yang menonjol adalah prolin dan hidroksiprolin
yang tinggi yaitu asam amino yang jarang ditemukan pada protein selain pada kolagen. Asam amino prolin dan hidroksiprolin mencapai kira-kira 21% dari