BAB II TINJAUAN PUSTAKA
III.3. Perkiraan Besar Sampel
Z2 (0,5 – /2).p.q
n ≥ e2
Keterangan : n = besar sampel
Z (0,5 – /2), dengan = 0,05 1,96
p = proporsi = 50% = 0,5 q = 1-p = 0,5
e = tingkat ketepatan 10% =0,1 maka n ≥ 96,04 ~ 96
Dari perhitungan di atas didapatkan besar sampel paling sedikit berkisar 96 nyamuk. Berdasarkan hal ini diambil sebanyak 100 sampel nyamuk (Arma, 2006).
III.4. Rancangan penelitian
Penelitian dilakukan secara deskriptif terhadap 100 sampel nyamuk A. aegypti
betina dengan metode Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) di SMF Mikrobiologi Klinik RSUP Haji Adam Malik Medan. Waktu penelitian dimulai dari bulan September 2008 sampai Januari 2009.
Tabel 1. Kegiatan dan waktu penelitian
September Oktober November Desember Januari No Kegiatan
II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II
1. Pengumpul an nyamuk 2. Ekstraksi 3. RT-PCR dengan menggunak an Primer DEN-3 4. Elektrofore sis dan Visualisasi dengan Gel Imaging
III.5.Kerangka Kerja
Ekstraksi RNA virus Dengue
RT-PCR dengan menggunakan Primer DEN-3
Elektroforesis
Pengumpulan sampel nyamuk A. aegypti betina
Visualisasi dengan gel imaging
III.6. Pelaksanaan Penelitian III.6.1. Alat dan Bahan Alat :
1. Tip 25 µL
2. Tip 200 µL
3. Vortexer (Maxi Mix II®)
4. Oven 50ºC 5. Pinset steril 6. Homogeniser steril 7. Microcentrifuge 8. Microwave 9. Beaker glass 10.Penggerus 11.Ice bath 12.Collection tube (2ml) 13.Tabung eppendorf 14.Tabung erlenmeyer
15.Tabung kultur dengan C6/36 cell line
16.Tabung kultur 12 ml (plastik screw cap) 17.Api bunsen 18.Aspirator 19.Inkubator 20.Baki steril 21.Freezer/refregerator -70 0 C 22.Mesin elektroforesis 23.Tangki elektroforesis
24.Multi block heater (Barnstead International ®)
25.Mesin centrifuge (Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge ®) 26.Mesin PCR (thermal cycler) (BioRad ®)
27.Lampu ultraviolet 28.Polaroid
29.Mesin pencitraan/imaging (BioRad ®)
Bahan :
1. Medium pertumbuhan MEM dengan 5% FBS (Foetal Bovinus Serum)
2. QIAamp® Viral RNA Mini Kit dari Qiagen (QIAamp MinElute Columns,
buffer AL, buffer AW 1, buffer AW 2, RNA-se free water atau buffer AVE, qiagen protease, carrier RNA, protease resuspension buffer)
3. MgSO4
4. Superscript III RT
5. Etanol 96-100%
6. Buffer TAE 50 ml
7. DMEM (Drainage Enrich Medium)
8. Aquadest 100 ml
9. Agarose 1 gram
10.Syber safe gel stainning 11.Blue juice
12.Gel imaging (Bio Rad)
III.6.2. Pengumpulan Data
Populasi nyamuk alam (natural population) vektor DBD, yaitu nyamuk A.
aegypti, ditangkap dari 5 kecamatan endemik DBD di wilayah Medan, Sumatera Utara, yaitu Medan Helvetia, Medan Selayang, Medan Sunggal, Medan Baru dan Medan Amplas dari bulan September-Oktober 2008. Nyamuk ditangkap dari habitat istirahat (resting places) di dalam rumah, terutama di tempat-tempat yang lembab, gelap dan pakaian yang tergantung serta di bawah kolong oleh 4 (empat) kolektor pada pagi hari (pukul 07.00-pukul 11.00 WIB).Diperiksa sebanyak 100 rumah dan pengumpulan nyamuk dilakukan di rumah-rumah di sekitar rumah penderita DBD atau sekitarnya berdasarkan hasil laporan dari Puskesmas atau Dinas Kesehatan.
Nyamuk hasil tangkapan dibawa ke laboratorium dan dimatikan dengan cara dimasukkan ke dalam kulkas dalam vial secara individual. Setelah mati, sampel nyamuk disimpan pada suhu -70°C. Sampel dipergunakan sebagai bahan untuk pemeriksaan virus. Virus yang akan diperiksa adalah virus Dengue serotipe-3 (DEN- 3).
III.6.3 Ekstraksi RNA Virus Dengue
Sebelum dilakukan ektraksi RNA virus Dengue, dilakukan persiapan sebagai
berikut :
1. Mempersiapkan Qiagen Protease
Sebanyak 1,4 ml buffer AVE ditambahkan ke dalam Qiagen Protease dengan
dicampurkan dan tidak menggunakan vortex. Hasil campuran dipisahkan ke dalam 5- 6 tabung eppendorf dimana masing-masing berukuran 250 µl (untuk 10 reaksi), kemudian disimpan ke dalam kulkas pada suhu -20 ºC.
2. Mempersiapkan Buffer AL
Sebanyak 310 µl buffer AVE ditambahkan ke dalam tabung berisi ’carrier RNA’
(310 µg). Kemudian pisahkan ke dalam 5 tabung eppendorf dimana masing-masing tabung berisi 62 µl (untuk 10 reaksi), dan disimpan pada suhu -20 ºC.
3. Mempersiapkan Buffer AW 1
Sebanyak 30 ml etanol 96-100% ditambahkan ke dalam buffer AW 1, lalu disimpan pada suhu ruangan.
4. Mempersiapkan Buffer AW 2
Sebanyak 30 ml etanol 96-100% ditambahkan ke dalam buffer AW 2, lalu disimpan pada suhu ruangan.
5. Mencampur Medium Virus
DMEM (Drainage Enrich Medium) dimasukkan ke dalam tabung kultur 12 ml
(plastik screw cap) sebanyak 0,5 ml per tabung. Lalu FBS sebanyak 0,5 ml
ditambahkan ke dalam DMEM dan disimpan di kulkas pada suhu 4°C.
Selanjutnya dilakukan ekstraksi RNA virus Dengue dengan cara sebagai berikut : Seekor nyamuk dengan menggunakan pinset steril dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah berisi 300 l medium virus (DMEM + FBS). Kemudian nyamuk digerus dengan penggerus steril dan selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C.
Supernatant hasil sentrifugasi diambil 200 l dengan menggunakan mikropipet dan kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang berisi 25 l
Qiagen protease. Setelah itu ditambahkan 200 l buffer AL dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 56 °C, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama
1 menit. Selanjutnya ditambahkan 250 l ethanol, ditutup dan dicampurkan dengan
menggunakan vortexer selama 15 detik, kemudian campuran tersebut diinkubasi
selama 5 menit pada suhu ruangan dan selanjutnya disentrifugasi lagi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Setelah dikeluarkan dari mesin sentrifugasi, campuran tersebut dimasukkan ke
dalam column dengan menggunakan mikropipet. Selanjutnya disentrifugasi lagi
dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Column kemudian dikeluarkan dari
mesin sentrifugasi dan collection tube yang mengandung filtrat dibuang dan column
dimasukkan ke dalam colection tube yang baru. Kemudian dilakukan berturut-turut pencucian dengan buffer AW-1, buffer AW-2 dan etanol, dengan cara menambahkan 500 l masing-masing larutan tersebut ke dalam campuran pada column, selanjutnya masing-masing disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Collection tube yang mengandung filtrat kembali dibuang dan column dimasukkan ke dalam collection tube yang baru. Hasilnya disentrifugasi dengan 14000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan (dry spin).
Column dimasukkan ke dalam collection tube yang baru dengan tutup terbuka, lalu diinkubasi dengan 56 ºC selama 3 menit. Kemudian collection tube dibuang, dan
column ditempatkan pada tabung microcentrifuge 1,5 ml. Buffer AVE sebanyak 20- 150 l (±50 l ) atau RNA-se free water dimasukkan ke tengah-tengah membran, lid ditutup dan diinkubasi selama 1 menit dalam suhu ruangan, lalu disentrifugasi dengan 14000 rpm selama 1 menit. Dari hasil sentrifugasi, column dibuang dan RNA yang telah diekstraksi disimpan dalam freezer dengan suhu -70 °C.
III.6.4. RT-PCR
Sebelum dilakukan RT-PCR, dipersiapkan terlebih dahulu Master mix yang dibuat dengan mencampurkan 25 l dari 2x reaksi mix (bufer yang terdiri dari 0,4 mM dari dNTP, 3.2 mM MgSO4), 1 l dari 10 M primer universal, 1 l dari 10 M primer D3, 2 l superscript III RT, 4 l MgSO4 dan ditambahkan aquadest sampai 20 l. Master mix ini dicampurkan dengan pipeting dan spin down.
Produk RNA dipersiapkan dengan memanaskan tube pada 65 °C selama 5 menit
dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di dalam es selama
mempersiapkan master mix. Kemudian 5 l produk RNA ditambahkan ke dalam
master mix, kemudian brief centrifuge dengan kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit, dan dimasukkan ke dalam mesin PCR.
Yang merupakan urutan program PCR adalah :
1. cDNA-sintesis,dengan suhu 60 °C selama 30 menit.
2. Pemanasan awal (hot start), dengan suhu 92 °C selama 3 menit. 3. Denaturasi (denaturation), dengan suhu 92 °C selama 30 detik. 4. Pendinginan (annealing), dengan suhu 53 °C selama 30 detik. 5. Perluasan (extension), dengan suhu 72 °C selama 1 menit.
6. Perluasan akhir (final extension), dengan suhu 72 °C selama 5 menit.
Langkah RT dilakukan pada suhu 60 °C selama 30 menit untuk menghasilkan cDNA, kemudian amplifikasi dengan langkah PCR berikut : 92 °C selama 3 menit untuk permulaan denaturasi, 92 °C selama 30 detik untuk denaturasi, 53 °C selama 30 detik untuk pendinginan dan 72 °C selama 1 menit untuk perluasan. Siklus ini
diulangi sebanyak 40 kali sebelum perluasan akhir dengan suhu 72 °C selama 5 menit. Produk PCR ini disimpan pada 4 °C sebelum digunakan.
III.6.5. Elektroforesis
Agarose 2% dibuat dengan cara mencampurkan 10 ml 1X TAE buffer dengan 100 ml aquades (pengenceran 10x). Kemudian 50 ml larutan tersebut dicampurkan dengan 1 gram agarose dan dipanaskan hingga mendidih. Kemudian ditambahkan
1:10.000 syber safe-TM dan dituang ke dalam cetakan gel agarose yang telah
disiapkan sesuai dengan jumlah sumuran (well) yang dibutuhkan.
Setelah gel agarose mengeras, dimasukkan dalam tangki elektroforesis yang berisi 1X TAE buffer. Sebanyak 5-10 µl hasil PCR ,yang telah dicampur blue juice
2X, dimasukkan ke dalam sumuran. Kemudian sebanyak 10 µl marker dimasukkan
juga pada sumur nomor 1 atau sumur terakhir.
Elektroforesis dijalankan 80-100 Volt, DNA akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif.
III.6.6. Gel Imaging
Setelah proses elektroforesis, gel dimasukkan ke dalam alat imaging untuk melihat hasil amplifikasi RNA virus dengue yang dilakukan dengan teknik RT-PCR.