BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.6. Polymerase Chain Raeaction (PCR)
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut
8
sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA (Hasibuan, E. 2015).
Metode PCR digunakan untuk meningkatkan jumlah urutan DNA menjadi ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µ, oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1µ dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 µl. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipat gandakan suatu sekuens DNA dalam genom bakteri (Hasibuan, E. 2015).
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah reaksi yang melibatkan enzim polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah proses pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat reponsif dengan perubahan suhu dan mesin thermal cycler, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan bahan-bahan untuk membuat reaksi PCR (Hasibuan, E. 2015).
Polymerase Chain Raeaction (PCR) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
9
Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya. Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi (Hasibuan, E. 2015).
Menurut Anonim 2012, PCR memiliki beberapa komponen utama, yaitu antara lain:
1. Asam deoksiribonukleat (DNA) Cetakan
Asam deoksiribonukleat (DNA) cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.
10
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded).
Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas selama 1 – 2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar sehingga primer akan “menempel”
(annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah.
2. Oligonukleotida primer
Polimerisasi DNA (replikasi DNA) hanya dapat dimulai jika tersedia molekul primer. Primer merupakan suatu molekul yang digunkan untuk mengawali proses polimerisasi untai DNA. Molekul primer dapat berupa molekul DNA, RNA atau bahkan protein spesifik. Hal ini berbeda dengan proses polimerisasi untaian RNA (proses transkripsi) yang tidak memerlukan primer. Selai itu, polimerisasi DNA juga mutlak memerlukan cetakan (template) yang dapat berupa untaian DNA dan RNA. Dalam proses replikasi DNA secara in vivo, primer berupa molekul RNA yang berukuran 10-12 nukleotida (Yuwono, T. 2005).
Pada jasad eukaryote yang mempunyai kromosom berupa untaian DNA linear, fungsi primer yang digunkan untuk replikasi ujung kromosom diketahui dilakukan oleh suatu protein khusus. Dalam proses polimerisasi DNA secara in vitro, misalnya amplifikasi DNA dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR), biasanya digunkan molekul DNA primer. Fungsi primer adalah menyediakan
11
ujung 3’-OH yang akan digunakan untuk menempelkan molekul DNA pertama dalam proses polimerisasi (Yuwono, T. 2005). Setelah primer disintesis dan menempel (anneal) pada DNA cetakan kemudian dilakukan sintesis DNA baru.
Molekul primer digunkan untuk menempelkan nukleotida pertama pada untaian DNA baru.
Pada proses sintesis untaian DNA lambat (lagging strand) diperlukan lebih dari satu primer. Hal itu disebabkan sintesis secara diskontinu. Untaian DNA yang baru disisntesis dengan menggunakan DNA cetakan (DNA”induk”) sebagai acuan sehingga DNA baru bersifat komplementer dengan cetakannya. Jika pada untaian DNA cetakan ada nukleotida A misalnya, maka akan diikatkan nukleotida T pada ujung 3’-OH primer, sedangkan jika pada cetakan ada nukleotida C maka akan diikatkan nukleotida G. demikian selanjutnya akan dilakukan pengikatan nukleotida-nukleotida pada ujung 3’-OH yang komplementer dengan cetakannya sehingga terjadi pemanjangan untaian DNA baru tersebut dikatalis oleh enzim DNA Polimerase III. Pada untaian DNA lambat, proses polimerisasi akan berlanjut sampai sampai DNA polymerase III bertemu dengan ujung 5’-P RNA primer yang menepel pada bagian lain. Pada titik ini DNA polymerase III akan terdisosiasi dari DNA cetakan.
Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA.
Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3’OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan
12
selama 1 – 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi selanjutnya didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya.
Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sampai 25 – 30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di dalam campuran reaksi.
Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 – 30 siklus amplikasi (Anonim 2012).
3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
Shanghai Shine Gene Moleculer Biotech, Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm.
13
dNTP yang siap digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat waktu dan untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya.
4. Asam deoksiribonukleat (DNA) Polimerase
Pada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli.
Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5’ → 3’)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa terdisosiasi dari komplek primer DNA cetakan.
5. Larutan Buffer
Larutan buffer PCR umumnya mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20 oC); 50 mM KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin);
Tween 20 sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%; disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.
Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur disosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi
14
DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+ yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan (Anonim, 2016)