Uji MPN dilakukan untuk mengetahui jumlah propagul infektif karena dalam penelitian ini salah satunya digunakan propagul CMA indigenous. Persiapan media tumbuh dan biji uji. Media zeolit yang akan digunakan untuk penyemaian dan media tanam terlebih dahulu disterilkan dengan menggunakan outoclave. Biji Puereria javanica digunakan sebagai inang disterilkan dengan direndam dalam larutan NaOCl selama 5 menit, selanjutnya dicuci bersih sampai baunya hilang dan direndam selama 24 jam. Biji- biji tersebut kemudian dikecambahkan di media zeolit steril dalam bak kecambah.
Persiapan seri pengenceran media. Seri pengenceran yang dibuat adalah seri pengenceran inokulan 40, 4-1, hingga 4-9. Seri pengenceran 40 adalah inokulum murni, seri pengenceran 4-1 adalah campuran 50 g inokulum murni dengan 150 g zeolit steril, pengenceran 4-2 adalah campuran campuran 50 g media dari seri pengenceran 4-1 dicampur dengan 150 g zeolit steril, dan seterusnya sampai dengan seri pengenceran 4-9. Setiap seri pengenceran diulang sebanyak 5 ulangan.
Kecambah yang telah tumbuh kemudian ditanam di dalam tabung kaca (test tube) sebanyak 25 g media tanam setiap test tube sesuai seri pengenceran. Kemudian disusun di rak dan dipelihara sampai umur 2 minggu.
Pemanenan dilakukan dengan cara memotong bagian akar tanaman. Akar-akar contoh kemudian diberi pewarnaan untuk melihat kolonisasi pada akar dengan menggunakan metode Phillip dan Hayman (1970) yang dikembangkan oleh Brundrett et al. (1996). Akar-akar yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 40 kali atau 60 kali. Hasil pengamatan dicatat dalam tabel pengamatan bila ada yang terkolonisasi diberi tanda (+) dan bila tidak ada diberi tanda (- ).
Perhitungan nilai MPN menggunakan rumus (Sivierding 1991) :
Y= s – x Keterangan :
O = Jumlah propagul infektif
x = Jumlah rata- rata yang terinfeksi s = Jumlah taraf pengenceran a = Faktor pengenceran
K = Nilai yang diperoleh dari tabel (Fisher dan Yates 1970 dalam Sivierding 1991)
Perhitungan selang kepercayaan 95 %: Log O SI = log O ± S O Z
v n Keterangan :
S = v 0.201 untuk pengenceran kelipatan 4 N = Jumlah ulangan perpengenceran Z = 1.645 untuk taraf 95%
3. Penanaman bibit A. crassicarpa
Persiapan benih
Benih A. crassicarpa yang akan dikecambahkan di seleksi terlebih dahulu dengan cara memilih bentuk biji yang baik dan sama besarnya. Untuk mempercepat perkecambahan dilakukan dengan merendam benih
K -a Log x. = LogΩ n pengencera per ulangan jumlah terinfeksi yang ulangan Jumlah x=
dalam air yang baru mendidih selama 2 detik, setelah itu air diganti dengan air dingin 25°C dan selanjutnya benih direndam selama 24 jam.
Persiapan media perkecambahan
Bak pengecambahan benih disiapkan sebanyak lima buah yaitu satu bak kecambah tanpa diberi inokulum dan 4 bak kecambah masing- masing diberi inokulum CMA jenis G. clarum, G. manihotis, G. etunicatum dan indigenous dengan menggunakan metode berlapis (layering technique). - Penyiapan bak kecambah tanpa inokulum :
Media zeolit dicuci bersih dari kotoran dan debu, dan dimasukan ke dalam bak kecambah ukuran 30cm x 25cm x 5cm yang bagian bawahnya telah dilubangi untuk drainase agar tidak tergenang. Benih A. crassicarpa kemudian ditaburkan di atas media dengan membuat jalur tanam di bak kecambah, setelah itu bagian atas ditaburi media tipis. Media kemudian disiram dengan air hingga kapasitas lapang dan kemudian ditutup kembali dengan menaburkan zeolit tipis diatasnya. Selama masa perkecambahan, kelembaban media dijaga dengan menyemprotkan air dengan sprayer. - Penyiapan bak kecambah dengan inokulum :
Inokulum yang digunakan adalah inokulum yang masih baru dan telah dihitung jumlah propagul infektifnya dengan metoda MPN (Sivierding 1991) (Lampiran 3 dan 4).
Pra- inokulasi benih dilakukan dengan sistem layering technique, yaitu 4 buah bak kecambah disiapkan untuk 4 jenis inokulum. Masing- masing bak dilapisi media zeolit steril, kemudian lapisan zeolit inokulum, kemudian dilapisi kembali dangan zeolit steril. Perbandingan berat zeolit steril dan zeolit bermikoriza 1 : 1 yaitu 1,5 kg zeolit steril dan 1,5 kg inokulum. Permukaan media kemudian dibuat alur-alur sebagai tempat benih ditaburkan. Setelah benih ditaburkan, zeolit kemudian ditaburkan tipis sampai menutupi permukaan benih. Kelembaban media dijaga sama dengan cara di atas.
Pengecekan infeksi pada kecambah
Pengecekan infeksi CMA pada kecambah mulai dilakukan saat berumur 2 minggu. Sampel kecambah yang akan dicek infeksinya diambil secara acak sebanyak 5 kecambah dari setiap bak kecambah, pada tempat pengambilan yang berbeda-beda. Untuk meyakinkan bahwa semai telah terinfeksi, dilakukan pengamatan hifa pada akar semai di bawah mikroskop biasa. Jika semua telah terinfeksi kecambah kemudian disapih ke polybag.
Persiapan Penyapihan
Penyiapan Larutan Bio-organik
- Larutan bio-organik 5% dibuat dengan cara 50 ml bio-organik diencerkan dengan air menjadi 1 liter larutan.
- Larutan bio- organik 10% dibuat dengan cara 100 ml bio-organik diencerkan dengan air menjadi 1 liter larutan.
- Larutan bio- organik 15% dibuat dengan cara 150 ml bio-organik diencerkan dengan air menjadi 1 liter larutan.
Penyiapan media sapih
Media tanam yang digunakan adalah ultisol yang telah diayak dibersihkan dari serasah, ranting-ranting dan batu. Selanjutnya media tanam dicampurkan dengan fungisida yang berbahan aktif Dazomet 98% sebanyak 60 g m-2 tanah dengan kedalaman 20 cm (Sieverding 1991) dengan menggunakan cangkul. Tanah yang telah tercampur rata kemudian dimasukan ke dalam kantong plastik besar, diikat dan diinkubasi selama 2 minggu. Setelah 2 minggu ikatan plastik dibuka dan dibiarkan agar terjadi penguapan sampai tidak mengeluarkan bau.
Media kemudian dimasukan ke dalam polybag. Media yang telah dimasukan ke dalam polybag selanjutnya diberi pupuk dasar dalam bentuk larutan dengan dosis 0,0166 g SP36, 0,035 g KCL dan 0,0163 g urea setiap polybag atau setara dengan 20 kg ha-1 P2O5 dalam bentuk SP36, 60 kg h-1 K2O dalam bentuk KCL dan 25 kg ha-1 N dalam bentuk Urea. Pupuk
urea diberikan sehari sebelum tanam untuk menghindari penguapan. Bersamaan dengan itu media disiram bio-organik sebanyak 75 ml pada masing- masing konsentrasi. Pemberian pupuk dasar dan bio-organik diberikan hanya satu kali dan kemudian polybag diinkubasi selama 1 minggu.
Penyapihan
Kecambah kemudian dipindahkan dari bak kecambah ke polybag. Pada saat pemindahan, kecambah diseleksi dengan melihat bentuk kecambah yang baik, yaitu berbatang lurus, sehat dan tinggi yang seragam. Media perkecambahan yang mangandung inokulan ditambahkan 10g bersamaan dengan penanaman kecambah ke dalam lubang tanam. Setelah selesai penanaman, tanaman kemudian disiram dan selanjutnya dibiarkan selama satu minggu untuk adaptasi. Jika ada kecambah yang mati penyulaman dapat dilakukan seminggu setelah tanam (1 MST).
Pemeliharaan
Semua polybag yang telah diberi perlakuan, diletakkan di rumah kaca dengan penataan sesuai pengacakan Rancangan Acak Kelompok pola faktorial. Pemeliharaan dilakukan dengan penyiraman secara teratur setiap pagi dan sore, dan untuk menjaga kelembaban, penyiraman juga dilakukan disekitar polybag dan lantai dasar tempat polybag. Penyiangan rumput dan pemberantasan hama dilakukan dengan cara manual.
