Fragmen F(ab)2 dari marmut atau disebut juga Ab1 digunakan untuk menginduksi antibodi anti-idiotipe (Ab2). Fragmen ini diemulsikan dengan menggunakan FCA yaitu
Freund’s adjuvant bentuk lengkap dan diimunisasikan pada kelinci. Dua ekor kelinci di imunisasi dengan Ab1, dan satu ekor kelinci sebagai kontrol. Satu minggu kemudian fragmen F(ab)2 diemulsikan dengan FIA yaitu Freund’s adjuvant bentuk tidak lengkap. Serum kelinci diperiksa keberadaan antibodi terhadap Ab1 dengan uji AGP.
Akibat rangsangan antibodi (Ab1) akan terbentuk antibodi dengan urutan asam amino khas yang diekspresikan sebagai epitop unik pada regio variabel molekul antibodi (Ab2). Idiotipe pada Ab2 digunakan sebagai dasar pembuatan vaksin yang potensial untuk melawan agen infeksius (Kennedy & Attanasio 1990).
Identifikasi serum kelinci dengan uji AGP menunjukkan terbentuknya garis presipitasi antara Ab1 dengan serum kelinci, hasil ini menunjukkan bahwa Ab2 memiliki kemiripan antigenic determinant dengan virus AI yang digunakan sebagai master seed
vaksin. Antibodi anti-idiotipe ini selanjutnya dimurnikan IgG-nya
Pemurnian IgG kelinci dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody Purification Kit & Spin Column with Procep A (Millipore). Pemurnian dilakukan untuk mendapatkan IgG murni. Imunoglobulin G kelinci adalah antibodi anti-idiotipe (Ab2) yang merupakan antibodi poliklonal yang mengandung antibodi dengan spesifisitas, afinitas dan isotipe yang berbeda. Antibodi poliklonal relatif stabil dan bereaksi dengan sejumlah antigen determinan yang berbeda, sehingga mengakibatkan terbentuknya komplek antigen-antibodi yang lebih besar dan mudah mempresipitasikan antigen.
Karakterisasi antibodi anti-idiotipe (Ab2) dilakukan dengan mengukur berat molekul dengan SDS-PAGE. Imunoglobulin G kelinci mempunyai berat molekul 150 kDa (Gambar 15).
4.3.2 Reidentifikasi Antibodi Anti-idiotipe (Ab2)
Hasil pemurnian Ig G kelinci selanjutnya diidentifikasi dengan uji AGP. Identifikasi menunjukkan reaksi positif yang ditandai dengan terbentuknya garis presipitasi antara Ab1 dan Ab2, artinya telah terbentuk antibodi terhadap Ab1 (Gambar 16).
Gambar 16 Antibodi Anti-idiotipe Sebagai Imunogen: Ab1. Antibodi AI H5N1; Ab2. Antibodi anti-idiotipe; ( → ) garis presipitasi
Adanya garis presipitasi merupakan adanya reaksi homolog antara Ab1 dan Ab2. Daerah variabel suatu antibodi yang mengikat antigen bersifat antigenik dan dapat menstimulasi terbentuknya antibodi terhadap daerah variabel itu sendiri jika disuntikkan
Ab1 Ab2 Ab2 Ab2 Ab2 Ab2 Ab2
pada hewan yang berbeda spesiesnya atau bahkan pada hewan yang sama spesiesnya (Migliorini & Schwartz 1988; Roitt 2003).
Antibodi ini disebut sebagai antibodi anti-idiotipe (Ab2) Avian Influenza H5N1. Akibat stimulasi antigen terhadap sel B akan terbentuk antibodi yang makin lama makin bertambah. Pada kadar tertentu, idiotipe dari antibodi tersebut akan bertindak sebagai stimulus imunogenik yang mengakibatkan terbentuknya anti-idiotipe. Anti-idiotipe yang terbentuk dengan sendirinya mirip antigen asal, karena itu dinamakan internal image dari antigen asal.
Antibodi Ab2 ini dapat digunakan sebagai antigen pengganti karena memiliki karakteristik yang sama dengan antigen aslinya terlihat dengan terbentuknya reaksi identitas parsial antara antibodi anti-idiotipe AI H5N1 dengan antigen H5N1 (Gambar 17). Reaksi ini menunjukkan virus AI H5N1 mempunyai determinan antigen yang sama dengan antibodi anti-idiotipe AI H5N1. Menurut Jerne 1985, daerah hipervariabel dari imunoglobulin dapat bersifat sebagai antigen dan antibodi yang terbentuk dari antigen tersebut merupakan antibodi anti-idiotipe yang dapat berikatan secara langsung dengan paratope atau daerah pengikatan antigen dari Ab1. Hasil uji AGP ini membuktikan bahwa Ab2 mempunyai kemampuan untuk meniru struktur antigen aslinya sehingga Ab2 dapat digunakan sebagai imunogen dalam pencegahan infeksi virus AI H5N1. Abu- Shakra et al. 1997 mengatakan bahwa molekul imunoglobulin yang merupakan protein bersifat antigenik sehingga hewan yang diimunisasi dengan imunoglobulin akan menghasilkan antibodi anti imunoglobulin yang dapat mencegah terjadinya penyakit. Preparasi vaksin untuk mengontrol infeksi viral dengan menggunakan prinsip antibodi anti-idiotipe telah dikembangkan dengan penelitian (Tackaberry et al. 1992; Zhou et al.
1994; Huang et al. 1995; Lin & Zhou 1995; Kennedy et al. 1996).
Gambar 17 Reaksi Identitas Parsial Imunoglobulin G Kelinci Spesifik Terhadap Ab1 dan Antigen Virus Avian Influenza H5N1: Ag. Antigen H5N1; Ab1. antibodi AI H5N1; Ab2. Antibodi anti-idiotipe; ( ) garis presipitasi
Konsentrasi IgG kelinci diukur dengan spektrofotometer ultraviolet yang diperoleh sebesar 8 mg/ml. Imunoglobulin G kelinci ini digunakan sebagai imunogen pengganti virus AI H5N1 yang diemulasikan dengan Freund’s adjuvant untuk imunisasi ayam SPF umur 4 minggu.
Adjuvan adalah substansi yang jika dicampurkan dengan antigen kemudian disuntikkan akan bekerja memperbesar imunogenesitas antigen sehingga akan memperkuat respon imun terhadap benda asing yang masuk ke dalam tubuh (Kuby 1997). Penggunaan adjuvan di dalam penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan respon imun tubuh sehingga antibodi yang terbentuk cukup banyak. Adjuvan membantu imunogen yang kurang imunogenik dalam menggertak sistem imun tubuh. Adjuvan digunakan untuk meningkatkan respon imun apabila antigen memiliki imunogenesitas rendah atau apabila jumlah antigen sedikit. Adjuvan juga dapat berfungsi sebagai depot antigen karena adjuvan sebagai pembawa antigen menuju lokasi sistem imun dan melepaskannya sedikit demi sedikit, sehingga masa pembentukan antibodi berlangsung lebih lama (Leenaars et al. 1994).
Penggunaan adjuvan untuk memacu respons imun dengan afinitas yang tinggi dengan cara memperluas permukaan antigen dan memperlambat pelepasan antigen dalam tubuh, sehingga pembentukan antibodi lebih optimal. Adjuvan memperluas permukaan antigen dan memperlama penyimpanan antigen di dalam tubuh sehingga
Ag Ab1 Ab2 1 2 3
memberi kesempatan pada sistem limfoid untuk menuju antigen sehingga antibodi akan diproduksi dalam jangka waktu lama (Bellanti 1993; Rantam 2005).
Akibat stimulasi antigen terhadap sel B akan terbentuk antibodi yang makin lama makin bertambah. Idiotip dari antibodi tersebut akan bertindak sebagai stimulus imunogenik yang mengakibatkan terbentuknya ant-idiotipe. Anti-idiotipe yang terbentuk juga mempunyai idiotip hingga akan merangsang terbentuknya anti anti idiotipe dan seterusnya.
Freund’s Complete Adjuvant berupa emulsi antigen cairan dalam minyak mineral mengandung mikobakterium mati karena pemanasan. Freund’s Incomplete Adjuvant
yaitu emulsi antigen cairan dalam minyak mineral tapi tidak mengandung mikobakterium.