3.2 Bahan dan Alat
3.3.3 Produksi Antibodi Anti-Idiotipe (Ab 2 ) Pada Kelinci
Antibodi anti-idiotipe (Ab2) disiapkan dengan cara menyuntik kelinci dengan Ab1 (F(ab)2). Produksi Ig G menggunakan 3 ekor kelinci New Zealand White berat 2.5 kg. Dua ekor kelinci diimunisasi dengan 500 µg Ab1 H5N1 dalam Freund’s Complete
Adjuvant (FCA) secara subcutan dan satu ekor kelinci sebagai kontrol. Imunisasi ulangan dilakukan satu minggu berikutnya dengan menyuntikkan 500 µg Ab1 dalam Freund’s
Incomplete Adjuvant (FIA) secara subcutan. Satu minggu kemudian serum dikoleksi dan identifikasi keberadaan Ab2 H5N1 strain Legok dengan uji AGP. Berat molekul ditentukan dengan metode SDS-PAGE dan konsentrasinya dihitung dengan spektofotometer ultra violet.
3.3.3.1Pemurnian Imunoglobulin G Kelinci Anti-Idiotipe (Ab2)
Pemurnian Imunoglobulin G (IgG) AI H5N1 dari serum kelinci (Ab2) dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody purification kit & spin column with Prosep A
media (Millipore). Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian
dimasukkan kedalam spin column. Spin column dicuci dengan 10 ml binding buffer, kemudian disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum marmut di saring dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 µm, selanjutnya sampel serum dilarutkan
dengan binding buffer dengan perbandingan 1:1 v/v, lalu dimasukkan kedalam spin column dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Spin column dicuci kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit, pencucian dilakukan sebanyak dua kali. Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml buffer dan elusi dilakukan langsung kedalam tabung sentrifus yang berisi 1.3 ml buffer netral, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 5 menit. Larutan yang ada dibawah ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG.
Reidentifikasi IgG kelinci dilakukan dengan uji AGP dan untuk mengetahui berat molekul IgG dilakukan SDS-PAGE (Hames & Rickwood 1987) dengan menggunakan sistem diskontinyu. Sistem ini terdiri atas gel pemisah dengan konsentrasi 12 % dan gel pengumpul dengan konsentrasi 4 %. Gel diwarnai dengan commassie blue dan estimasi berat molekul protein berdasarkan perbandingan dengan marker umum berat molekul, selanjutnya konsentrasi IgG dihitung dengan menggunakan spektrofotometer ultra violet.
3.3.4 Imunogenesitas “Kandidat Vaksin” (Antibodi Anti-idiotipe)
Imunisasi Antibodi Anti-idiotipe (Ab2) pada ayam dilakukan untuk mendeteksi terbentuknya antibodi terhadap Ab2. Antibodi yang diperoleh dari serum ayam merupakan antibodi anti anti-idiotipe (Ab3). Antibodi ini diharapkan mempunyai karakteristik serologi sama dengan antibodi dari serum marmut (Ab1), sehingga mampu bereaksi homolog dengan Ab2 maupun dengan antigen virus AI.
Imunisasi dilakukan sebagai berikut: sebanyak 20 ekor ayam dibagi @ 5 ekor menjadi 4 kelompok, yaitu kelompok I sebagai kontrol; kelompok II sebagai kelompok Ig G kelinci kontrol, kelompok III sebagai kelompok kandidat vaksin (antibodi anti- idiotipe) dan kelompok IV sebagai kelompok vaksin AI H5N1. Kelompok kontrol adalah kelompok ayam yang tidak diberi perlakuan. Kelompok Ig G kelinci kontrol adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 500 µg Ig G kelinci kontrol dalam FCA secara intramuscular. Kelompok antibodi anti-idiotipe adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 500 µg Ab2 dalam FCA secara intramuscular. Kelompok vaksin AI H5N1 adalah kelompok ayam yang diimunisasi dengan 1 dosis vaksin komersil AI H5N1
inaktif strain Legok secara intramuscular. Serum darah dikoleksi sebelum imunisasi (preimunisasi) dan tiap minggu post imunisasi selama 1 bulan. Pengukuran titer antibodi dari imunisasi antibodi anti-idiotipe (Ab2) menggunakan uji HI dan uji serum netralisasi (SN) (Ditjennak 2007; WHO 2002).
3.3.4.1 Uji Serologi Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab3) dengan Uji HI
Persiapan untuk melakukan uji serologi antibodi anti anti-idiotipe (Ab3) dengan uji HI adalah dengan memproduksi antigen AI (Lampiran 15) dari beberapa isolat, yaitu isolat AI H5N1 IPB (2007), isolat AI H5N1 IPB (2008), dan isolat AI H5N1 IPB (2009), sedangkan antigen AI H5N1 strain Legok (2003) diperoleh dari Balitvet.
Uji serologi antibodi anti anti-idiotipe (Ab3) dengan uji HI sebagai berikut: sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam setiap lubang pada microplate 96 lubang, kemudian ditambahkan 25 µl serum pada lubang yang pertama. Serum diencerkan dengan kelipatan 2 sampai lubang ke 11, kemudian ditambahkan dengan 25 µl antigen (4 HAU) pada semua lubang. Microplate diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit, selanjutnya ditambahkan 25 µl sel darah merah ayam SPF 1% pada semua lubang. Larutan tersebut diinkubasikan selama 40 menit pada suhu kamar. Titer antibodi ditentukan dari pengenceran tertinggi serum yang mampu menghambat aglutinasi sel darah merah.
3.3.4.2 Uji Serologi Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab3) dengan Uji SN
Persiapan untuk melakukan uji serologi anti anti-idiotipe (Ab3) dengan uji SN adalah dengan mempropagasi dan mengukur kandungan virus dari isolat AI H5N1 strain Legok (2003), isolat AI H5N1 IPB (2005) dan isolat A/Goose/Bojonggenteng/IPB2- RS/2006 pada TAB dan sel MDCK (Lampiran 14)
Uji serum netralisasi dilakukan dengan menggunakan biakan sel MDCK. Sebanyak 25 µl medium dimasukkan ke dalam setiap lubang microplate (96 well), kemudian 25 µl serum pada lubang yang pertama. Serum diencerkan dengan kelipatan 2 sampai lubang ke 11, kemudian ditambahkan dengan 25 µl virus AI (100 TCID50 ) pada semua lubang. Microplate diinkubasi dalam inkubator pada suhu 370 C dengan 5% CO2 selama satu jam, selanjutnya ditambahkan dengan 100 µl sel MDCK (106 sel/ml) pada
semua lubang. Biakan sel diinkubasi dalam inkubator pada suhu 370 C dengan 5% CO2. Pengamatan dilakukan setiap hari selama 7 hari. Titer antibodi ditentukan dari pengenceran tertinggi serum yang mampu menetralisasi efek sitopatik.
3.3.5 Analisis Data
Karakteristik uji dari antibodi anti-idiotipe dianalisis secara deskriptif yaitu berdasarkan gambaran hasil yang diperoleh dan secara statistik dengan menggunakan metode Mann Whitney dengan soft ware SPSS-16 dengan tingkat kepercayaan (P-
value) 0.05. Mann Whitney adalah metode statistik yang digunakan untuk membedakan dua parameter dengan data non parametrik. Salah satu indikasi untuk mengetahui suatu data parametrik atau tidak adalah dengan melihat sebaran data (distribusi normal berarti parametrik) (Field 2005).
IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Reidentifikasi Vaksin AI H5N1
Vaksin AI H5N1 inaktif strain Legok diekstraksi RNAnya dan diidentifikasi subtipe virus AI-nya berdasarkan gen hemaglutinin (HA) dan neuraminidase (NA). Reidentifikasi ini penting dilakukan untuk mengetahui bahwa master seed yang digunakan memiliki hemaglutinin H5 dan neuraminidase N1. Vaksin AI yang beredar di Indonesia harus terdaftar di Departemen Pertanian dan diuji mutunya di BBPMSOH (Lampiran 1). Spesifikasi master seed yang digunakan dalam produksi vaksin harus identik dengan keterangan dalam label vaksin (Ditjennak 2007).
Reidentifikasi vaksin AI H5N1 inaktif strain Legok dengan uji RT-PCR menggunakan primer H5 (Lee & Suarez 2004) dan primer N1 menunjukkan hasil positif terhadap virus AI subtipe H5N1. Gambaran pita DNA H5 berada pada 55 pb sesuai dengan primer subtipe H5 (Gambar 8) dan pita DNA N1 berada pada 120 pb sesuai dengan primer subtipe N1 (Gambar 9). Hasil ini menunjukkan bahwa vaksin tersebut menggunakan master seed H5N1. Master seed ini adalah virus AI yang berasal dari isolat lapang saat wabah AI pertamakali terjadi di Indonesia. Isolat berasal dari ayam yang terinfeksi oleh virus AI subtipe H5N1 dari daerah Legok, Banten. Penggunaan isolat tersebut sebagai master seed vaksin produksi lokal merupakan kebijakan pemerintah RI saat keadaan darurat untuk mengatasi wabah AI saat itu walaupun master seed vaksin AI yang direkomendasikan oleh OIE harus berasal dari isolat virus yang Low Pathogenic Avian Influenza (LPAI) (OIE 2004).
Beberapa kejadian menunjukkan bahwa tidak semua primer H5 dapat digunakan untuk melacak subtipe H5N1. Konfirmasi yang paling tepat untuk menentukan primer adalah dengan mengetahui urutan nukleotida gen HA dan NA (Suwarno et al. 2006).
1 2 3 4 M
Gambar 8 Uji Identitas Vaksin AI H5N1 inaktif Strain Legok dengan uji RT-PCR menggunakan Primer subtipe H5 (produk 55 pb): 1. Kontrol negatif; 2. Kontrol negatif H5; 3. Vaksin; 4. Kontrol positif H5; M. Marker 50 pb (Invitrogen)
4 3 2 1 M
Gambar 9 Uji Identitas Vaksin AI H5N1 inaktif Strain Legok dengan uji RT-PCR menggunakan Primer subtipe N1 (produk 120 pb): 1. Kontrol negatif; 2. Kontrol negatif N1; 3. Kontrol positif N1; 4. Vaksin; M. Marker 100 pb (Invitrogen)