variasi pH dan lama fermentasi, dengan tujuan untuk mengetahui kombinasi perlakuan yang paling optimum. Pada penelitian ini proses sakarifikasi dan fermentasi dilakukan secara serentak. Proses ini sebenarmya hampir sama dengan proses terpisah antara hidrolisis enzim dengan proses fermentasi, hanya dalam proses sakarifikasi dan fermentasi serentak, hidrolisis dan fermentasi dilakukan dalam satu reaktor. Samsuri (2007) mengungkapkan bahwa keuntungan dari proses ini adalah polisakarida yang terkonversi menjadi monosakarida tidak kembali menjadi polisakarida karena monosakarida langsung difermentasi menjadi etanol. selain itu dengan menggunakan satu reaktor dalam prosesnya akan mengurangi biaya yang digunakan.
Fermentasi merupakan tahap paling kritis dalam produksi etanol. Fermentasi merupakan proses biokimia dimana mikroba yang berperan dalam fermentasi akan menghasilkan enzim yang mampu mengonversi substrat menjadi bioetanol. Proses fermentasi melibatkan mikroorganisme khamir yang merupakan hasil isolasi dari tetes tebu. Isolat khamir dari tetes tebu ini mempunyai waktu inkubasi optimum 18 jam. Pada jam ke-18 inokulum sudah bisa digunakan untuk proses fermentasi. Berdasarkan pada kurva pertumbuhannya, pada jam ke-18 ini khamir mengalami fase eksponensial, dimana sel mulai membelah dan masuk ke dalam periode pertumbuhan, reproduksi sel paling aktif dan waktu regenerasinya konstan, ini dibuktikan dengan nilai absorbansi yang mulai meningkat.
Penelitian ini menggunakan kombinasi kajian variasi pH dan lama fermentasi. Sebelum fermentasi dilakukan perlakuan untuk mempersiapkan sampel sesuai pH yang dikehendaki, yaitu pH 4; 4,5; 5. Pengaturan PH dengan menambahkan HCl 7 % ke dalam sampel dan pengecekan pH menggunakan indikator pH universal. Media fermentasi yang telah siap ditambahkan inokulum sebanyak 10 mL dan diinkubasi selama waktu 5; 7; 9; 11 hari.
Salah satu faktor yang harus diperhatikan dalam proses fermentasi adalah medium fermentasi. Medium sebagai tempat tumbuh dan berkembang harus menjamin ketersediaan dan kebutuhan mikroba untuk hidup dan tumbuh berkembang. Jika mikroba kekurangan nutrien maka akan mengganggu metabolisme sel. Medium fermentasi mengandung sumber karbon yang dapat dimanfaatkan oleh khamir. Sumber karbon yang dimanfaatkan adalah gula, seperti fruktosa, galaktosa, sukrosa. Khamir, yaitu Saccharomyces cerevisiae dapat menghasilkan enzim zimase dan invertase. Enzim invertase berfungsi untuk memecah sukrosa menjadi gula sederhana (glukosa dan fruktosa), dan enzim zimase merombak glukosa menjadi etanol.
Setelah fermentasi aerobik selesai, dilanjutkan dengan fermentasi anaerobik, yaitu tanpa adanya suplai oksigen. Fermentasi ini merupakan proses konversi glukosa menjadi etanol dengan bantuan enzim zimase yang terbentuk selama proses berlangsung. Menurut Rose (1967), fermentasi glukosa ini berjalan lebih cepat dan spontan karena sifatnya yang fermentatif. Hal ini akan menimbulkan panas yang menyebabkan suhu fermentator terus meningkat.
Kondisi ini sesuai dengan keadaan ketika perlakuan berlangsung dimana wadah tempat substrat mengalami peningkatan suhu menjadi hangat.
Pada fermentasi pada limbah padat tapioka yang lebih lanjut alkohol oleh enzim alkoholase dapat diubah menjadi asam asetat, asam piruvat dan asam laktat. Terbentuknya asam asetat, asam piruvat dan asam laktat karena adanya bakteri Acetobacter yang sering terdapat dalam ragi yang bersifat oksidatif. (Buckle, et all., 1985), menyatakan bahwa asam piruvat adalah produk yang terbentuk pada hidrolisis glukosa menjadi etanol. Asam piruvat dapat diubah menjadi etanol dan asam laktat. Asam-asam organik dari alkohol membentuk ester aromatik sehingga tape memiliki cita rasa yang khas.
Fermentasi anaerobik berjalan sesuai biosintesis Embden-Meyerhof
Pathway (EMP), yaitu reaksi konversi menjadi asam piruvat yang kemudian dapat
diubah menjadi berbagai produk, salah satunya adalah etanol. Secara garis besar, selama proses berlangsung, dua molekul ADP diubah menjadi ATP. Selanjutnya ATP tersebut diregenerasi kembali menjadi ADP, dan pada akhir proses fermentasi dihasilkan dua mol ATP.
Glukosa + 2 Pi + 2 ADP 2 alkohol + 2 ATP
Senyawa ATP yang dihasilkan dari jalur anaerobik ini membutuhkan 2 mol senyawa fosfat sebagai nutrisi untuk setiap mol glukosa yang mengalami metabolisme. Sumber senyawa fosfat bebas ini berasal dari reaksi-reaksi yang mengonsumsi ATP dan mengeluarkan senyawa monofosfat. Senyawa ATP yang dihasilkan ini merupakan energi tinggi yang melepaskan panas ke lingkungan, sehingga suhu fermentasi berangsur-angsur meningkat.
Tahap glikolisis berdasarkan skema Embden-Meyerhof Pathway (EMP) (Gambar 4.5), dimulai dari glukosa. Reaksi tahap pertama terjadi reaksi fosforolasi yang mengubah glukosa menjadi glukosa 6-fosfat yang disertai dengan penguraian ATP menjadi ADP. Tahap kedua merupakan isomerasi glukosa 6-fosfat menjadi fruktosa 6-6-fosfat, tetapi tidak terjadi penguraian maupun pembentukan ATP. Fruktosa 6-fosfat ini selanjutnya diubah menjadi fruktosa 1,6-difosfat dengan memasukkan gugus fosfat dari ATP. Tahap berikutnya, fruktosa 1,6-difosfat mengalami pemecahan menjadi dua senyawa, yaitu gliseraldehida 3-fosfat dan dihidroksiaseton 3-fosfat. Dalam keadaan normal dihidroksiaseton 3-fosfat diubah seluruhnya menjadi yaitu gliseraldehida 3-fosfat sehingga kemungkinan hilangnya setengah dari energi molekul glukosa dapat dicegah. Reaksi kelima terjadi perubahan gliseraldehida 3-fosfat menjadi asam 1,3-difosfogliserat, yang melibatkan reaksi pemasukan satu gugus fosfat dari asam fosfat. Reaksi ini disertai dengan reaksi reduksi pembentukan NADH dari NAD+. Asam 1,3-difosfogliserat kemudian mengalami defosforilasi menjadi 3-P-asam gliserat dengan melepaskan fofat dan aseptor fosfat ADP membentuk ATP. Reaksi selanjutnya adalah isomerasi asam gliserat 3-fosfat menjadi asam gliserat 2-fosfat yang berlanjut membentuk asam fosfoenol piruvat dengan menghasilkan ATP. Tahap terakhir reaksi glikolisis ditandai dengan pembentukan asam piruvat dari asam fosfoenol piruvat. Terbentuknya asam piruvat merpakan awal dari terjadinya fermentasi alkohol. Reaksi ini ditandai dengan terjadi reaksi perubahan asam piruvat menjadi asetaldehida, dan selanjutnya direduksi oleh NADH dengan
enzim zimase, asetaldehida akan diubah menjadi etanol dan CO2 yang merupakan hasil akhir fermentasi alkohol.
Glukosa
Gliseraldehida 3 - P
Asam 1,3 - difosfo gliserat