SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Nama Mahasiswa : Samanhudi Nomor Pokok : A156010041 Program Studi : Agronomi
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. H. Roedhy Poerwanto, M.Sc Dr. Ir. H. Djoko Santoso, M.Sc
Ketua Anggota
Dr. Ir. Sobir, M.Si Dr. Ir. Agus Purwito, M.Sc
Anggota Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Agronomi Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Satriyas Ilyas, M.S Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S
Penulis dilahirkan di Kudus, Jawa Tengah pada tanggal 10 Juni 1968
sebagai anak ke tujuh dari tujuh bersaudara pasangan ayah Sutono (alm) dan
ibu Hj. Siti Aminah.
Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas
Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta (UNS) dan lulus tahun 1993.
Pada tahun 1998, penulis melanjutkan ke program magister pada Program Studi
Agronomi, Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor dan lulus tahun 2001.
Pada tahun 2001 itu pula penulis mendapatkan kesempatan untuk melanjutkan
ke program doktor pada program studi dan perguruan tinggi yang sama, dengan
beasiswa BPPS dari Departemen Pendidikan Nasional.
Penulis pernah bekerja sebagai Sarjana Pendamping Purna Waktu
(SP2W) untuk Program Inpres Desa Tertinggal (IDT) BAPPENAS pada tahun
1994 sampai dengan tahun 1997. Sejak tahun 1995 penulis diangkat sebagai
staf pengajar di Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas
Sebelas Maret Surakarta.
Penulis menikah dengan Iswatun, S.Pd pada tahun 1995 dan dikaruniai
dua orang anak, yaitu Aninditya Verinda Putrinadia (10 tahun) dan Luthfiana
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat,
taufik dan hidayah-Nya sehingga penelitian dan penulisan disertasi berjudul
“Studi Pembungaan dan Isolasi Gen APETALA1 pada Kakao (Theobroma cacao L.)” dapat terlaksana.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan penghargaan dan terima
kasih yang tulus kepada Bapak Prof. Dr. Ir. H. Roedhy Poerwanto, M.Sc sebagai
Ketua Komisi Pembimbing, atas segala bimbingan dan arahan beliau yang
cermat, terarah dan sistematis mulai dari penyusunan proposal, pelaksanaan
penelitian, sampai dengan penulisan laporan disertasi ini. Penghargaan dan
ucapan terima kasih yang tulus juga disampaikan kepada Bapak Dr. Ir. H. Djoko
Santoso, M.Sc, Bapak Dr. Ir. Sobir, M.Si dan Bapak Dr. Ir. Agus Purwito, M.Sc
sebagai Anggota Komisi Pembimbing, atas bimbingan dan saran-saran beliau
yang sangat berharga untuk mempertajam pemikiran penulis dalam perencanaan
dan pelaksanaan penelitian serta penulisan disertasi ini.
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Rektor Universitas Sebelas
Maret dan Dekan Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta, atas
ijin dan kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti program
doktor di Institut Pertanian Bogor. Kepada Rektor Institut Pertanian Bogor, Dekan
Sekolah Pascasarjana IPB, Dekan Fakultas Pertanian IPB dan Ketua Program
Studi Agronomi SPS-IPB, disampaikan terima kasih dan penghargaan atas
segala fasilitas dan pelayanannya.
Terima kasih yang mendalam juga disampaikan kepada Kementerian
Riset dan Teknologi yang telah membiayai penelitian ini sepenuhnya, melalui
program Riset Unggulan Terpadu Internasional (RUTI). Ucapan terima kasih juga
penelitian kepada penulis untuk melakukan penelitian di Belanda. Kepada
Direktur PT Perkebunan Nusantara VIII Jawa Barat beserta staf dan Kepala Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, yang telah memberikan ijin dan
fasilitas untuk penelitian ini, penulis sampaikan terima kasih. Kepada pengelola
BPPS Ditjen Dikti, Departemen Pendidikan Nasional, disampaikan terima kasih
atas beasiswa yang telah diberikan.
Rasa hormat dan terima kasih yang tulus penulis persembahkan kepada
Ibunda Hj. Siti Aminah dan almarhum Ayahanda Sutono, beserta seluruh
anggota keluarga, yang telah memberikan doa restu, dorongan, semangat dan
motivasi, serta dukungan finansial. Penghargaan dan kebanggaan dengan
segala ketulusan disampaikan kepada istrinda tercinta Iswatun, S.Pd dan anak-
anakku tersayang Aninditya Verinda Putrinadia dan Luthfiana Nadhiifa
Khoirunnisa, atas segala doa, pengorbanan, pengertian, ketabahan dan
dorongan semangat yang telah diberikan selama penulis menyelesaikan
pendidikan Strata-3 di Sekolah Pascasarjana IPB.
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Prof. Dr. Ir. Gerco C Angenent,
Dr. Ruud A. de Maagd, Dr. Ir. Richard G.H. Immink dan Marco Busscher dari
Plant Research International yang telah memberikan bimbingan, fasilitas dan pelayanan kepada penulis selama melakukan penelitian di Belanda. Terima kasih
dan penghargaan yang tulus juga disampaikan kepada Ibu Dr. Ir. Tetty
Chaidamsari, M.Si yang dengan sabarnya beliau bersedia membimbing dan
menuntun penulis selama penulis melakukan penelitian di Belanda. Dari beliau
juga penulis mendapatkan banyak pengetahuan tentang biologi molekuler.
Kepada Arief Rachmawan, S.Si, Herti Sugiarti, Niyyah Fitranti, S.Si dan Marini
Bapak Dr. Ir. Darda Efendi, M.Si, Bapak Dr. Ir. Hasanuddin Ibrahim, Sp.I dan
Bapak Prof. Dr. Ir. Bambang Sapta Purwoko, M.Sc yang telah bersedia menjadi
penguji luar komisi pembimbing atas pertanyaan dan saran-saran untuk
perbaikan dalam penulisan disertasi ini.
Kepada rekan-rekan mahasiswa Program Studi Agronomi, Sekolah
Pascasarjana IPB, terima kasih atas kerja samanya selama ini. Kepada semua
pihak yang telah membantu penulis, baik pada saat pengamatan di lapangan,
analisis kimia di laboratorium maupun dalam penulisan disertasi ini yang tidak
dapat penulis sebutkan satu per satu disampaikan terima kasih.
Akhirnya penulis berharap semoga laporan disertasi ini bermanfaat bagi
kita semua. Semoga Allah SWT membalas kebaikan bapak, ibu dan saudara
semua dan memberikan kemudahan dalam segala urusan. Amiin.
Bogor, Juni 2006
Halaman DAFTAR TABEL ... DAFTAR GAMBAR ……….. DAFTAR SINGKATAN ... I. PENDAHULUAN ...………..……... Latar Belakang ……..…………...………... Perumusan Masalah .………....……….……….... Tujuan Penelitian ………....………...……... Hipotesis Penelitian ...………...…….…………... Manfaat Penelitian ..………...………...
II. TINJAUAN PUSTAKA ...……..………...
Botani dan Morfologi Tanaman Kakao ...………...
Fisiologi Pembungaan .……...…...……..…………...
Senyawa Penginduksi Pembungaan ………...………..
Perubahan Zat Endogen selama Induksi Pembungaan ...
Studi Molekuler Pembungaan .………...………...
III. INDUKSI PEMBUNGAAN PADA TANAMAN KAKAO ...
Abstrak ...
Pendahuluan ...
Bahan dan Metode ...
Bahan Tanaman ...
Prosedur Pelaksanaan ...
Hasil dan Pembahasan ...
Kesimpulan ...
IV. PERUBAHAN KANDUNGAN BEBERAPA ZAT ENDOGEN PADA TANAMAN KAKAO SELAMA INDUKSI PEMBUNGAAN ...
Abstrak ...
Pendahuluan ...
Bahan dan Metode ...
Bahan Tanaman ...
Prosedur Pelaksanaan ...
Hasil dan Pembahasan ...
Kandungan Giberelin ...
Kandungan Sukrosa ...
Kandungan Karbohidrat Total ...
Kandungan Nitrogen ... Nisbah C/N ... Kesimpulan ... xiv xv xvii 1 1 5 7 7 8 9 9 11 13 19 21 31 31 31 34 34 34 36 49 51 51 51 53 53 54 55 55 58 60 63 64 67 xi
KAKAO ...
Abstrak ...
Pendahuluan ...
Bahan dan Metode ...
Bahan Tanaman ...
Isolasi RNA Bunga Kakao .……….
Perancangan Primer Heterologous Spesifik AP1 ...
Sintesis First-Strand cDNA Bunga Kakao ...
Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) ………..………….
Ekstraksi dan Purifikasi AP1 …...
Kloning AP1 ke dalam Vektor pGEM-T Easy .………...
Miniprep DNA Plasmid ...………...
Sekuensing dan Analisis Hasil Sekuensing ……..………..
Hasil dan Pembahasan ...
Isolasi AP1 dari Jaringan Bunga Kakao ...
Analisis Sekuen AP1 dari Tanaman Kakao ...
Kesimpulan ...
VI. UJI EKSPRESI GEN APETALA1 PADA BERBAGAI JARINGAN TANAMAN KAKAO ...
Abstrak ...
Pendahuluan ...
Bahan dan Metode ...
Bahan Tanaman ...
Isolasi RNA dari berbagai Jaringan Tanaman Kakao .…..
Perancangan Primer Homologous Spesifik AP1 ...
Sintesis First-Strand cDNA dan RT-PCR ...
Hasil dan Pembahasan ...
Isolasi AP1 dari berbagai Jaringan Tanaman Kakao ...
Ekspresi AP1 pada berbagai Jaringan Tanaman Kakao ...
Kesimpulan ...
VII. UJI EKSPRESI GEN TcAP1 (APETALA1 KAKAO) PADA TANAMAN MODEL ...
Abstrak ...
Pendahuluan ...
Bahan dan Metode ...
Bahan Tanaman ...
Modifikasi dan Transformasi Genetik ..…...
Kultur Jaringan ...
Polymerase Chain Reaction (PCR) ...
Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) ………..………….
Hasil dan Pembahasan ...
Kesimpulan ... 68 68 68 70 70 71 72 73 73 74 75 76 77 78 78 83 91 92 92 92 94 94 95 96 96 97 97 99 104 105 105 105 107 107 107 108 108 109 110 115 xii
IX. KESIMPULAN DAN SARAN ... Kesimpulan ... Saran ... DAFTAR PUSTAKA ... LAMPIRAN ... GLOSSARY ... 130 130 131 132 143 156 xiii
Halaman
1
2
Rata-rata saat muncul bunga pertama, waktu berbunga, jumlah tandan bunga, jumlah bunga, saat muncul pentil pertama, jumlah pentil total, persentase pentil layu, jumlah pentil sehat, jumlah tunas, panjang tunas dan jumlah daun pada tanaman kakao yang diinduksi pembungaannya ...
Seleksi koloni hasil transformasi AP1 ke dalam vektor kloning ...
38
81
Halaman 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Kerangka studi pembungaan dan isolasi gen APETALA1 pada
tanaman kakao serta target yang akan dicapai ...
Lokasi penghambatan biosintesis giberelin oleh CCC dan paklo- butrazol (Rademacher 1995; Williams et al. 1999) ...
Alur genetik perkembangan bunga pada Arabidopsis (Blazquez
2000) ...………...………...
Grafik perkembangan jumlah bunga kakao ...
Grafik perkembangan jumlah pentil total ...
Grafik perkembangan jumlah pentil sehat ...
Penampilan bunga kakao pada 24 HSP (Hari Setelah Perlakuan) ..
Penampilan bunga kakao pada 12 HSM (Hari Setelah Muncul) ...
Kandungan giberelin bantalan bunga kakao pada 0 dan 3 MSP ...
Kandungan sukrosa bantalan bunga kakao pada 0 dan 3 MSP ...
Kandungan karbohidrat bantalan bunga kakao pada 0 dan 3 MSP ..
Kandungan nitrogen bantalan bunga kakao pada 0 dan 3 MSP ...
Nisbah C/N bantalan bunga kakao pada 0 dan 3 MSP ...
Hasil elektroforesis RNA total bunga kakao ...
Hasil RT-PCR cDNA bunga kakao ...
Hasil miniprep DNA plasmid ...
Hasil digesti DNA plasmid dengan enzim EcoRI ...
Sekuen nukleotida full-length AP1 pada tanaman kakao (824 pb) ...
Hasil BLASTN sekuen nukleotida AP1 kakao (824 pb) ...
Hasil BLASTP sekuen asam amino AP1 kakao (241 aa) ...
Hasil alignment sekuen asam amino AP1 kakao dengan beberapa spesies lain menggunakan Program ClustalW ...
6 15 23 39 40 42 46 46 56 59 61 63 65 78 80 82 82 83 85 86 88 xv
23 24 25 26 27 28 29 30 31
Hasil analisis phylogenetic tree antara protein TcAP1 (AP1 kakao)
dengan protein MADS-box lain menggunakan Program TreeView ..
Hasil elektroforesis RNA total dari berbagai jaringan tanaman kakao ...
Ekspresi AP1 pada berbagai jaringan tanaman kakao ...
Pengujian PCR spesifik TcAP1 terhadap DNA genomik planlet tembakau ...
Morfologi kultur planlet tembakau setelah transformasi genetik ...
Hasil RT-PCR spesifik TcAP1 terhadap RNA total daun planlet tembakau ...
Planlet tembakau in vitro pada umur 3.5 bulan ...
Diagram model gen ABC (Yanofsky 1995) ...
Bunga kakao dan diagram susunan organ bunga ...
90 98 100 110 112 113 115 124 125 xvi
ABA = Abscisic acid AG = AGAMOUS AGL = AGAMOUS-LIKE AP1 = APETALA1 AP2 = APETALA2 AP3 = APETALA3
AtLFY = Arabidopsis thaliana LEAFY
b.a. = Bahan aktif BA = Benzyl Adenine BAP = Benzyl Amino Purin
BLAST = Basic Local Alignment Search Tool
CAL = CAULIFLOWER
CaMV 35S = Cauliflower mosaic virus 35S CCC = Chlorocholine Chloride cDNA = Complementary DNA
CTAB = Cetyltrimethyl Ammonium Bromide DNA = Deoxyribo Nucleic Acid
dNTP = Deoxynucleoside Triphosphate dpl = Diatas permukaan laut
DTT = Dithiothreitol EB = Extraction Buffer
EDTA = Ethylenediamine Tetraacetic
EMBL-EBI = European Molecular Biology Laboratory – European Bioinformatics Institute
EMF = EMBRIONIC FLOWER
FBP = FLORAL BINDING PROTEIN
GA3 = Gibberellic Acid
HPLC = High Performance Liquid Chromatography HSP = Hari Setelah Perlakuan
IPTG = Isopropyl β-D-thio-galactopyranoside Kb = Kilobase
KNO3 = Potassium Nitrate
LB = Left Border
LB media = Luria Bertani media
LEC2 = LEAFY COTYLEDON2
LLSEP3 = Lilium longiflorum SEPALLATA3
MADS = MCM1 AGAMOUS DEFICIENS SRF MdMADS = Malus domestica MADS
MgCl2 = Magnesium Chloride
MQ = MilliQ grade water mRNA = Messenger RNA
MS media = Murashige & Skoog media MSP = Minggu Setelah Perlakuan NaCl = Natrium Chloride
NCBI = National Center for Biotechnological Information NEB buffer = New England Biolabs buffer
NtAP1 = Nicotiana tabacum APETALA1 NtLFY = Nicotiana tabacum LEAFY
O/N = Overnight
pb = Pasang basa
PCR = Polymerase Chain Reaction PE buffer = Polyethylene buffer
pH = Power of hydrogen
PI = PISTILLATA
ppm = Part per million
PVPP = Polyvinyl Polypyrollidone RB = Right border
RNA = Ribonucleic Acid RNase = Ribonuclease
rpm = Rotations per minute
RT-PCR = Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction
SEP3 = SEPALLATA3
Taq = Thermophilus aquaticus
TBM = Tanaman Belum Menghasilkan
TcAG = Theobroma cacao AGAMOUS TcAP1 = Theobroma cacao APETALA1 TFL1 = TERMINAL FLOWER1 UAH = Upper Amazone Hybrid
X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
Latar Belakang
Tanaman kakao (Theobroma cacao L.) merupakan salah satu komoditas perkebunan yang perkembangannya sangat pesat, terutama perkebunan rakyat
dan perkebunan swasta. Potensi pengembangan kakao di Indonesia cukup
besar, baik sumber daya yang dimiliki, teknologi yang dikuasai, maupun
peluang pasar dalam dan luar negeri yang akan terus berkembang pada masa
yang akan datang.
Kakao merupakan salah satu komoditas ekspor Indonesia yang penting,
karena Indonesia merupakan negara penghasil kakao terbesar ke dua di dunia
setelah Pantai Gading. Areal tanaman kakao yang diusahakan di Indonesia pada
tahun 2003 seluas 961.107 ha dengan total produksi sebesar 695.361 ton
serta tingkat produktivitasnya sebesar 723.5 kg/ha/tahun (Departemen Pertanian
2006). Salah satu usaha untuk meningkatkan produksi kakao yaitu dengan
meningkatkan produktivitasnya. Produktivitas kakao di Indonesia masih
memungkinkan untuk ditingkatkan karena didukung oleh tersedianya tenaga
kerja yang banyak serta teknologi yang cukup.
Produksi kakao yang dihasilkan tersebut belum mampu memenuhi
kebutuhan pasar dunia, apalagi mutu biji kakao Indonesia masih tergolong
rendah. Hal ini disebabkan sebagian besar pengusahaan kakao di Indonesia
masih bersifat sederhana, serta teknik budidaya yang belum dikuasai sepenuh-
nya. Karena itu diperlukan pengelolaan yang lebih intensif untuk meningkatkan
produktivitasnya. Salah satu aspek fisiologis yang penting dalam hubungannya
dengan peningkatan produksi buah kakao adalah pertumbuhan reproduktif yang