Tahap IV: Karakterisasi Minyak Ikan Patin Murn
PROSEDUR ANALISIS
a. Kadar lemak (AOAC 2006)
Sebanyak 2 gram contoh dikeringkan dalam oven (105ºC) terlebih dahulu selama kurang lebih 2 jam diatas kertas saring bebas lemak. Selanjutnya contoh yang sudah kering dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam labu soxhlet (labu sochlet sebelumnya dikeringkan dalam oven, dimasukkan ke dalam desikator lalu ditimbang). Dimasukkan pelarut petroleum eter kemudian dilakukan reflux selama 6 jam. Lalu labu berisi hasil reflux dipanaskan dalam oven dengan suhu 1050C hingga menguap. Setelah itu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar lemak dihitung dengan rumus :
Kadar lemak (%) = x 100%
sampel lemak
berat berat
b. Kadar iodine (AOAC 2006)
Angka Iod adalah jumlah gam iod yang dapat diikat oleh 100 gam lemak atau minyak. Untuk mengetahui angka iod menimbang kurang lebih 0,1 g minyak hasil ekstraksi dalam botol timbang, kemudian dipindahkan pada erlenmeyer 300 ml dengan menambahkan eter sebanyak 3 ml, lalu ditambah 20 ml larutan iodine monoklorida (reagent wijs), tutup dan kocok selama 1 menit. Setelah itu ditambah larutan KI 10% sebanyak 10 ml dan ditambah aquades sebanyak 50 ml. Kemudian dititrasi dengan larutan standar thio-sulfat 0,1 N sampai warna kuning muda, lalu diberi larutan amilum 1% sebanyak 1-2 ml kemudian dititrasi lagi hingga warna biru hilang. Dilakukan juga terhadap blanko.
ml titrasi (blanko – sampel)
Perhitungan = x N Thio x 12,691
c. Angka Asam (AOAC 2006)
Angka asam adalah banyaknya miligram KOH yang diperlukan untuk menetralkan asam lemak bebas dalam 1 gram minyak atau lemak. Untuk mengetahui angka asam minyak/lemak sebanyak ± 5 g masukkan dalam erlenmeyer dan ditambah 50 mL alkohol netral 95% kemudian dipanaskan dalam penangas air sambil diaduk dan ditutup pendingin balik. Alkohol berfungsi untuk melarutkan asam lemak. Setelah didinginkan kemudian dititrasi dengan KOH 0,1 N menggunakan indikator PP sampai tepat berwarna merah jambu.
ml KOH x N KOH x BM KOH
Perhitungan =
Berat sampel (g)
d. Bilangan penyabunan (AOCS 2005)
Angka penyabunan adalah banyaknya miligram KOH yang dibutuhkan untuk menyabunkan 1 gram minyak atau lemak. Untuk mengetahui angka penyabunan minyak yang telah diekstraksi seperti di atas + 2 g ditimbang dalam botol timbang kemudian pindahkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 25 ml KOH 0,5 N dalam alkohol serta beberapa butir batu didih. Setelah ditutup dengan pendingin balik, dididihkan dengan hati-hati selama 1 jam sehingga minyak dan KOH bercampur homogen. Setelah dingin ditambahkan beberapa tetes indikator PP dan titrasi kelebihan KOH dengan larutan standar 0,5 N HCl sampai menjadi tidak berwarna. Hal ini dilakukan terhadap blanko (titrasi tanpa menggunakan sampel).
28,05 x (titrasi blanko – titrasi sampel) Perhitungan =
Berat sampel (g)
e. Bilangan Peroksida (AOCS 2005)
Contoh ditimbang sebanyak 5 ± 0.005 g dalam erlenmeyer 250 ml bertutup dan tambahkan 30 ml larutan asam asetat : kloroform (3 : 2). Erlenmeyer dikocok hingga bahan semua terlarut. Kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh dan didiamkan di tempat gelap selama 1 menit dengan kadang kala mengocoknya. Ditambahkan aquades sebanyak 30 ml kemudian dititrasi
dengan Na2S2O3 0,1N sampai warna kuning hampir hilang. Ditambahkan 0,5 ml larutan pati 1% dan lanjutkan titrasi sampai warna biru tepat menghilang.
Bilangan peroksida dinyatakan dalam nilai equivalen dari peroksida dalam setiap 100 g contoh.
ml Na2S2O3 x N Thio x 1000 Bilangan peroksida =
Berat contoh (g)
f. Profil asam lemak (AOAC 2006)
Analisis profil dan komposisi asam lemak terdiri dari 2 tahap yaitu tahap metilasi dan identifikasi. Tahap metilasi adalah sebagai berikut : Sebanyak kurang lebih 20 – 40 mg minyak ikan ditimbang dan ditambahkan 1 ml NaOH 0.5 N dalam Metanol kemudian dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Selanjutnya ditambahkan 2 ml BF3 20% panaskan lagi selama 2 menit. Ditambahkan 5 ml heptana dan didihkan selama 1 menit. Ditambahkan larutan NaCl jenuh untuk menguapkan larutan heptana hingga leher tabung. Selanjutnya 1 ml lapisan heptana dipindahkan dengan bantuan pipet tetes kedalam tabung kemudian ditambahkan ± 0.1 g Na2SO4 anhidrat untuk menghilangkan air, biarkan 15 menit. Fasa cair selanjutnya diinjeksikan ke kromatografi gas.
Tahap identifikasi asam lemak dilakukan dengan cara menginjeksikan 1 µl methyl ester pada kromatogafi gas (GC) dengan spesifikasi sebagai berikut : Kolom : Cyanopropil methyl sil (capilary coloumn)
Dimensi kolom : p=60 m, diameter dalam= 0.25 mm, 0.25 µm film thickness
Suhu Kolom : Suhu terprogam yaitu 125 ºC (suhu awal) selama 5
menit, kemudian dinaikkan dengan kecepatan 10 ºC /menit sampai 185 ºC. Selanjutnya dinaikkan
dengan kecepatan 5 ºC/menit sampai suhu 205 ºC dipertahankan selama 10 menit dan dinaikkan kembali dengan kecepatan 3 ºC/menit sampai suhu 225 ºC dipertahankan selama 7 menit.
Detektor : FID Suhu detektor : 240 ºC Suhu injektor : 220 ºC
Gas pembawa : Helium 30 ml/menit
Gas pembakar : Hidrogen (40 ml/menit) dan udara (400 ml/menit)
Untuk identifikasi asam lemak dalam sampel dilakukan dengan mencocokkan waktu retensi peak asam lemak sampel dengan waktu retensi peak standar FAME murni yang terdiri dari : C4:0, C6:0, C8:0, C10:0, C11:0, C12:0, C13:0, C14:0, C14:1, C15:0, C15:1, C16:0, C16:1, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1n9t, C18:1n9c, C18:2n6t, C18:2n6c, 18:3n3, 18:3n6, C20:0, C20:1, C20:2, C20:3n6, C20:3n3, C20:4n6, C20:5n3, C21:0, C22:0, C22:1n9, C22:2, C22:6n3, C23:0, C24:0 dan C24:1.
Untuk menghitung jumlah asam lemak jenuh maupun tidak jenuh dilakukan dengan dua tahap yaitu:
Membandingkan waktu retensi (RT) asam lemak yang terdapat dalam sampel dengan waktu retensi asam lemak dalam standar eksternal. Menghitung asam lemak yang teridentifikasi dalam sampel (% b/b)
dengan rumus sebagai berikut :
Ax/As x C standar x V contoh/100 x 100%
Gram contoh
Di mana :
V contoh = volume contoh
Cs = Konsentrasi standar
Ax = Luas puncak komponen x
As = Luas puncak standar
g. Analisa Gugus Fungsi
Gugus fungsi dalam komponen ditentukan secara spektroskopi FTIR Prinsip FTIR adalah identifikasi gugus fungsi sampel berdasarkan penyerapan gelombang infra merah vibrasi rotasi. Besarnya energi vibrasi dan vibrasi rotasi bersifat khas untuk tiap jenis ikatan. Sistem pengukuran yang digunakan adalah
Diffuse Reflectance Spectroscopy (DRS). Bubuk KBr sebanyak 200 mg ditambahkan dengan sampel minyak dan dihomogenasi. Campuran dimasukkan kedalam tempat sampel dan di analisis pada panjang gelombang 400 – 5000 cm-1
h. Penentuan Profil Gliserida (Jennings dan Akoh, 2001)
Penentuan profil gliserida dilakukan melalui tahap (1) Hidrolisis secara enzimatis (2) Analisa profil gliserida menggunakan reversed phase HPLC
(1) Hidrolisis secara enzimatis
Pertama-tama dibuat campuran yang terdiri dari minyak ikan 1 ml, 1 ml bufer tris (hidroksimetil) aminomethane 1.0 M, pH 8, 0.2 ml larutan kalsium klorida 2.2 % dan enzim lipase dari kapang Thermomyces lanuginosa spesifik 1,3 sebanyak 10% dari berat minyak. Campuran tersebut kemudian diinkubasikan didalam
waterbath shaker pada suhu 55 ºC selama 12,18 dan 48 jam. Pada akhir waktu hidrolisis, ditambahkan etanol sebanyak 1 ml dan larutan asam hidroklorida sebanyak 1 ml. Ekstraksi lemak dilakukan dengan menggunakan dietil eter sebanyak 1 ml. Campuran kemudian divortex dan disentrifuge pada suhu 5 ºC dengan kecepatan 2185 g selama 15 menit.
(2) Profil gliserida menggunakan sistem NARP-HPLC (non aqueous reversed- phase HPLC)
Larutan dari tahap persiapan sampel diinjeksikan 20 μL ke dalam HPLC dengan menggunakan syringe. HPLC yang digunakan memiliki tipe pompa isokratik dengan laju aliran fase bergerak yang terdiri dari aseton: asetonitril (85:15 v/v). Kolom yang digunakan adalah dua kolom C-18. Waktu retensi dari pelarut dan puncak trigliserida, juga persentase dari tiap trigliserida.
Spesifikasi alat HPLC yang digunakan adalah: Pump Hewlett Packard Series 1100, Detector RID Agilent Technologies 1100 Series, Injector Rheodyne 20 μL, Column C-18 phase; ZORBAX Eclipse XDB (4,6 x 250 mm), Mobile phase aseton : asetonitril = 85 : 15, dan kecepatan elusi 0.8 ml/min (isokratik).
i. Warna
Pengukuran warna minyak dilakukan menggunakan alat Chromameter Minolta CR 300. Sampel minyak diteteskan pada tempat sampel pada alat kemudian ditutup dan alat dijalankan. Notasi – notasi yang muncul dari hasil pengukuran yaitu L*, a* dan b*. Notasi L* menyatakan nilai kecerahan dengan kisaran angka dari 0 – 100 (paling cerah). Notasi a* menyatakan warna
kehijauan (positif) dan kemerahan (negatif). Notasi b* menyatakan warna kuning (positif) dan biru (negatif).
j. Viskositas
Pengukuran viskositas dilakukan dengan alat viscometer Brookfield. Sampel minyak yang telah disimpan beku dithawing terlebih dahulu dengan cara botol minyak direndam air di sekelilingnya dan dipanaskan diatas penangas air pada suhu 30 ºC hingga minyak mencair sempurna. Minyak kemudian diukur viskositasnya menggunakan spindel 1 dengan kecepatan 30 rpm.
k. Titik leleh (Melting Point) dengan alat DSC (Sathivel et al. 2008)
Minyak ditimbang sebanyak 0.5 – 1 mg dan diletakkan dalam pan sampel aluminium (crucible) pada alat DSC. Pan aluminium kosong diletakkan sebagai referensi. Penentuan titik leleh minyak dilakukan dengan cara mengatur suhu pemanasan -75 ºC hingga 125 ºC dengan kenaikan suhu sebesar 5 ºC/menit.
